Архив рубрики «Клиника»

Наши попытки пометить клоны

в наши попытки пометить клоны1982. В описанный метод прогулки вдоль хромосомы могут быть введены дополнительные усовершенствования, причем некоторые из них в настоящее время уже испытываются в ряде лабораторий. Например, метод рекомбинации и селекции in vivo — сходный с тем, который описан для библиотек на основе бактериофага К Seed, 1983, — применяется вместо скрининга путем гибридизации Poustka et al.1984. К тому же в конструировании библиотек, обогащенных нужными последовательностями ДНК, может помочь выделение хромосом или фрагментов хромосом с помощью фракционирования по размерам, сортировки под контролем флуоресценции или же переноса ДНК в клетки с другой генетической структурой. Наконец, для выделения большого числа зондов из представляющего интерес участка, что ускоряет прогулку вдоль хромосомы, могут применяться опыты по прыжкам вдоль хромосомы McClelland et al.1948 и микрохирургия определенных участков хромосомы Roh- me et al.1984. Нет сомнений, что метод прогулка вдоль хромосомы будет широко использоваться в будущем для построения молекулярных карт больших участков хромосомы, а также для выделения и характеристики генетических областей, для которых единственными зондами являются соседние гены. Это существенно для обнаружения и характеристики пока не известных генов, а также при картировании элементов, важных для эволюции хромосом млекопитающих, таких как горячие точки при рекомбинации. В настоящей главе описаны методы, позволяющие вводить гены в лимфоидные клетки. Конкретно речь идет о слиянии с бактериальными протопластами и о копреципитации ДНК с фосфатом кальция. Эти методы просты, их можно применять в любой лаборатории, поскольку они не требуют сложного оборудования.

блог про покер

На протяжении последних нескольких лет

на протяжении последних нескольких лет средуVoller et al.1976. Изотип-специфический иммуноферментный анализ осуществляют следующим образом. Полистиреновые лунки микропанелей Dynathech, Billinghurst, Sussex, Англия обрабатывают в течение ночи при 4С иммуноглобулиновой фракцией кроличьей антисыворотки к р,- у- или а-цепям человека, полученной от фирмы Dakopatts Copenhagen, Дания; 50 мкгмл IgG в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7,5, или мышиными монокло- нальными антителами Е-45 против е-цепей человека 10 мкгмл; любезно предоставленными G. Damiani из Генуэзского университета. Лунки промывают ЗФР и вносят в них определенные разведения проб в ЗФР — 5 СПК при комнатной температуре на 2 ч. Лунки промывают и на следующие 2 ч вносят меченные щелочной фосфатазой кроличьи антитела к р,- у- и а-цепям человека. Для количественного определения IgE добавляют кроличьи антитела к -цепи человека, а затем конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антитела к иммуноглобулинам кролика. После окончательной отмывки определяют связанную с лунками ферментативную активность, используя раствор п-нитрофенилфосфата 1 мгмл в 10-ном ди- этаноламиновом буфере, рН 9,8. Оптическое поглощение измеряют на автоматическом фотометре Flow Multiskan. Для построения стандартных кривых используют стандартную сыворотку или известное количество очищенного иммуноглобулина. Чувствительность теста составляет 10 нгмл для IgM, IgG и IgA и 0,5 нгмл для IgE. Примесь очищенного иммуноглобулина постороннего изотипа вплоть до концентрации 10 мкгмл в тесте не обнаруживается. Т-клетки, повторно стимулированные во вторичной СКЛ и размноженные в среде GM в течение 1-2 нед, растут в суспензии, состоящей из отдельных клеток, и обладают жизнеспособностью, близкой к 100.

Группа компаний Пожарный эксперт: аудит пожарной безопасности. Проверка систем пожаротушения.

Противоположные взаимодействия

делают так, противоположные взаимодействия семиНесмотря на сообщения о возможности длительного культивирования нетрансформированных В-клеточных линий Howard et al.1981, по-прежнему отсутствуют надежные и воспроизводимые методы получения и поддержания таких линий. Целью этой главы является не обсуждение моделей активации В-клеток, а описание методик определения активности факторов, стимулирующих пролиферацию В-клеток. Для того чтобы методика тестирования была приемлемой, она должна отвечать ряду требований. В системе должно достигаться насыщение, т. е. кривая титрования активности должна иметь выход на плато. При разбавлении фактора эта кривая должна соответствовать одноударной кинетике, и, наконец, в предельных разведениях должен достигаться фоновый уровень. Применение культуральных сред на основе RPMI 1640 или модифицированной Дульбекко минимальной среды с коррекцией по Искову дает примерно одинаковые результаты. К этим средам добавляют антибиотики, р-меркаптоэтанол 5- Ю-5 М и соответствующее количество сыворотки плода коровы СПК см. ниже. К среде RPMI добавляют также L-глу- тамин и пируват до конечной концентрации 1. б. Партии СПК проверяют на митогенную активность и на способность поддерживать стимулированную митогенами пролиферацию лимфоцитов. Рутинное тестирование, применяемое в нашей лаборатории, включает стимуляцию спленоцитов мышей C57BL6 в концентрации 1,5-10-105 клетокмл липополи- сахаридом ЛПС или Кон-А. Сыворотку из новой партии титруют против сыворотки из уже проверенной партии, используемой в качестве стандарта, и через два дня культивирования определяют включение тимидина в стимулированных и нести- мулированных культурах. Кроме того, на четвертый и шестой день культивирования определяют синтез БОК IgM и IgG3 соответственно.

facebook на русском

С помощью ОФ-ВЖХ

Это достигается с помощью введения в клетки наряду с изучаемым геном доминантного селектируемого маркера. Как показал Виглер, при введении гена тимидинкиназы вируса простого герпеса HSV-tk в 1-клетки и применении селективного давления среда ГАТ появляются стабильные трансформанты, которые наследуют ген HSV-tk Wigler et al.1977. Следовательно, при добавлении среды ГАТ нетрансфор- мированные клетки элиминируются, и благодаря этому можно получать чистую популяцию трансформированных клеток. Другими доминантными селектируемыми генами являются ген резистентности к неомицину пеот и ген резистентности к мико- феноловой кислоте gpt. Селективную среду ГАТ используют и в системе фибро- бластов, поскольку эффективность переноса гена в эти клетки довольно высока, а частота спонтанной реверсии для линии Ltkr очень низка 10-7. В практическом плане существенным является вопрос о доступности агента, применяемого для селекции. Среда ГАТ хороша тем, что она недорого стоит и ее легко приготовить. Многочисленные линии В- и Т-лимфоцитов, адаптированные для гибридомной техники, обладают фенотипом tkr, поэтому данную систему селекции в принципе можно применять и для этих клеточных линий. Однако частота стабильного переноса генов в лимфоидные клетки нередко очень близка к частоте спонтанной реверсии для многих из этих клеточных линий. Маллиган и Берг Mulligan, Berg, 1981 показали, что ген бактериальной ксантин — гуанин-фосфорибозилтрансферазы часто называемый геном gpt в комбинации с эукариотически- ми последовательностями, контролирующими транскрипцию, может функционировать в эукариотических клетках, придавая этим клеткам устойчивость к такому антибиотику, как мико- феноловая кислота. К тому же, поскольку этот ген является прокариотическим, клетки эукариот не могут приобретать спонтанную резистентность и этот ген можно переносить в любую клеточную линию, иными словами, не требуется наличия в трансформируемых клетках генетической мутации. Поскольку фермент gpt в пути биосинтеза находится после гипоксантин- фосфорибозилтрансферазы ГФРТ, соответствующий ген можно переносить в многочисленные линии миелом, тимом и макрофагов, обладающих фенотипом ГФРТ-; при этом будет происходить синтез GMP, компенсирующий мутацию ГФРТ. Колберт-Гарапин и др. Colbert-Garapin et al.1981, а также Саузерн и Берг Southern, Berg, 1982 показали, что при присоединении к гену бактериальной фосфотрансферазы АРН3П пеот генетических элементов, контролирующих транскрипцию, можно после введения соответствующего гена в эукариотические клетки передавать устойчивость к аминогли- козидному антибиотику G-418. Антибиотик G-418 по структуре сходен с неомицином, и ген, придающий резистентность к G-418, часто называют пеот. Поскольку пеот является прокариотическим геном он содержится в транспозонах Тп5 и ТпбО, эукариотические клетки не могут приобретать спонтанную резистентность к антибиотику.

Разумнее всего начинать строительство деревянного дома в начале лета. А вот стоимость строительства дома из бревна можно узнать в любое время года заранее.

Сбор Фракций

сбор фракций собиралиМинимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Millipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий обычно около 6 ч при 37 С клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 С используют для последующего отбора положительных колоний. Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее разд. IV, А. Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга разд. IV, Б, который прогревают 10- 15 мин при 70 С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию разд. IV, В-Д. Положительный клон высевают штрихом в свежую чашку с агаром L-амп и подготавливают ночную культуру для выделения ДНК в среде L-амп. 1 мл ночной культуры вносят в стерильный пластиковый флакон, содержащий 70 мкл ДМСО. Флакон закрывают крышкой, его содержимое перемешивают на вортексе, быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -70 С.

Студия красоты Планета Солнца: стоун-терапия цена. Массаж горячими камнями.

Потеря антигенной активности

соответствует 2-105 потеря антигенной активности избежание денатурацииЕе успешно использовали для получения МА, продуцируемых всеми имеющимися в нашем распоряжении линиями гибридом. К последним относятся более чем 30 линий, продуцирующих мышиные и крысиные иммуноглобулины практически всех изотипов. Кроме того, мы использовали эту среду для получения больших количеств культуральной жидкости, содержащей лимфокины. Основное преимущество, которое дает применение этой среды, состоит в замене сыворотки или сывороточных заменителей например, липидов и альбумина смесью поддерживающих рост клеток компонентов. Эту смесь легко готовить, и она достаточно дешевая. Поскольку компоненты смеси, такие как трансферрин, этаноламин, инсулин и селенит натрия, могут заменять сыворотку и поддерживать рост и секрецию продуктов гибридными или трансформированными клетками, упрощается и выделение секретируемых клетками веществ. Вероятно, трансформированные клетки не обладают столь строгими требованиями в отношении присутствия в среде липидов, как нормальные свежевыделенные из организмов кл. етки Iscove, Melchers, 1978. Отметим два момента, требующих особого внимания при работе с этой бессывороточной культуральной средой. Во-первых, адаптировать клетки к бессывороточной среде необходимо постепенно, достаточно медленно. Клеточные культуры в средней или в поздней логарифмической фазе растущие на среде, содержащей сыворотку, следует разводить бессывороточной средой в соотношении 1 4. Эту процедуру повторяют три раза по мере того, как клетки культуры делятся. Во-вторых, необходимо избегать как слишком малых, так и слишком больших концентраций клеток.

Посмотреть про деловые сувениры заказать тут.

С правой стороны

1982 и вновь растворяют в ТЭ-буфере 2 мл в течение ночи. После центрифугирования из пробирок с помощью насоса медленно отбирают фракции по 0,7 мл собирают около 30 фракций с помощью коллектора. По 10 мкл каждой из фракций 1-17 анализируют в 0,3-ном агарозном геле вместе с маркерными фрагментами ДНК фага К, которые наносят на среднюю и крайние дорожки геля. К маркерным фрагментам добавляют по 10 мкл 40-ного раствора сахарозы, чтобы концентрация сахарозы и солей в них была такой же, как и в пробах. Длительность электрофореза составляет 16 ч при 40 В. Фракции, содержащие фрагменты ДНК размером от 30 до 50 kb, объединяют фракции, содержащие фрагменты ДНК размером 30 kb отбрасывают и осаждают 2,5 объемами этанола соль дополнительно не добавляют. Материал перемешивают и оставляют при -25 С на ночь. На следующий день пробирки нагревают до комнатной температуры для того чтобы растворить сахарозу, если она выпала в осадок и собирают ДНК центрифугированием. Если общий объем составляет 10 мл, то ДНК осаждают в полиалломерной пробирке ротора SW27. Чтобы пробирка не разрушилась при центрифугировании, ее заполняют доверху 70-ным этанолом. Длительность центрифу- Представленная ниже пропись относится к космидному вектору pNNL Brosveld et al.1982, содержащему ген Eco-gpt, облегчающий перенос клонированных генов в эукариотические клетки. Эту пропись с соответствующими модификациями можно применить и в случае других космидных векторов. Одну аликвоту ДНК вектора pNNL 20 мкг гидролизуют рестрикта- зой Нра, а другую такую же — рестриктазой Clal. Добавляют по 20 ед. каждого фермента инкубируют 4 ч при 37 С.

Перед проявлением кассетам

перед проявлением кассетамТакой подход дает возможность выявить исключить многие белки, которые являются общими для всех типов лимфоцитов, а также значительно облегчает идентификацию белков, специфичных для определенных стадий дифференцировки, так как карты двумерного электрофореза получают при анализе клонированных популяций, замороженных на определенной стадии процесса дифференцировки. Используя этот подход, мы можем с большей вероятностью идентифицировать белковые маркеры, которые в обычных условиях экспрессиру- ются на немногочисленных субпопуляциях лимфоцитов. Для получения максимального разрешения биосинтетически меченные лизаты клеток анализировали, применяя два различных метода разделения белков. Хотя оба метода включают фракционирование белков в первом направлении по заряду, при одном из них изоэлектрическом фокусировании, ИЭФ белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками pi, а при другом неравновесном электрофорезе в градиенте рН, НЭГрН в соответствии с их подвижностью в градиенте рН. При НЭГрН время электрофоретического разделения не достаточно для того, чтобы белки достигли своих значений pi. Поэтому разделение зависит как от суммарного электрического заряда, так и от размера белковой молекулы. Из нашего опыта следует, что НЭГрН дает лучшее разрешение для интересующего нас класса белков. На рис. 10-2 приведены примеры разделения тем и другим методом при исследовании одного и того же меченного 35S клеточного лизата. Анализ, проводимый для идентификации белков — кандидатов на роль стадиеспецифических маркеров, включает двух- этапный отбор данных в соответствии с избранными критериями. Во-первых, белковые карты каждой В-клеточной линии сопоставляют с белковыми картами Т-клеточных лимфом, список которых приведен в табл. 10-1, и выделяют белки, характерные только для В-лимфоцитов. В принципе эти различия выражаются в абсолютном отсутствии соответствующих фракций на электрофореграммах Т-клеток. Возможны и количественные различия в экспрессии белков, которые можно выявить, если имеется разница примерно в пять или более раз. После выявления специфических для В-клеток кандидатов на роль маркеров проводят сопоставление белковых профилей пре-В и плазматических клеток и дальнейший поиск маркеров стадий дифференцировки. Подобный анчлиз позволяет идентифициро- Для того чтобы убедиться в том, что эти молекулы являются наружными мембранными белками, необходимы дальнейшие эксперименты. С этой целью готовят препараты плазматических мембран из целых клеток, предварительно меченных тотально 35Б-метионином или меченных по поверхности клеток 12SI с помощью реагента 1ос1о?ел Fraker, Speck, 1978. Меченые белки анализируют методом двумерного гель-электрофореза и элект- рофореграммы поверхностных белков сопоставляют с аналогичными электрофореграммами, полученными для тотальных клеточных лизатов, как описано выше.

Виноградная диета

Клетка млекопитающих

для клетка млекопитающих следующийИспользование аллореактивных хелперных клонов позволяет разработать хелперный тест, обладающий следующими характеристиками 1 активация В-клеток происходит в культурах, которые не содержат специфических цитотоксических предшественников, и, следовательно, в этих культурах не возникает цитотоксической супрессорной активности; 2 к пролиферации и синтезу антител индуцируется большая часть В- клеток; 3 В-клетки активируются независимо от специфичности вырабатываемых ими антител и в отсутствие чужеродных антигенов. Необходимость использования клонированных Т-клеток для получения сильной поликлональной активации В-клеток определяется тем, что те же самые хелперные клоны, которые запускают В-клеточный ответ, выполняют хелперные функции в отношении цитотоксических предшественников Ramarli et al.1984. Поэтому, если в культуры, в которых В-клеточный ответ стимулируется с помощью аллореактивного хелперного клона, добавить Т-клетки периферической крови, аллогенные по отношению к используемым В-клеткам, то одновременно со стимуляцией В-клеток происходит специфическая цитотоксиче- ская реакция и, следовательно, подавление В-клеточного ответа. Вместе с тем Т-клетки периферической крови, которые аутологичны активированным В-клеткам, существенно не влияют на продукцию антител, так как среди них нет специфических цитотоксических предшественников. Настоящий метод обеспечивает возможность использования неограниченного числа хелперных Т-клеток и позволяет избежать возникновения супрессорной активности. Поэтому с его помощью удается получить такой уровень поликлональной активации В-клеток, который приблизительно в 100 раз превосходит уровень активации, достигаемый обычными методами с использованием митогена из лаконоса или вируса Эпштей- на — Барра Yarchoan et al.1983. Эти преимущества становятся особенно очевидными, если сравнивать эффективность клонирования и размер клонов В-клеток. Из результатов, представленных в табл. 16-1, можно сделать вывод, что отдельная активированная В-клетка может разделиться в среднем 8 раз на протяжении 8 сут и дать начало клону, вырабатывающему нанограммы антител. Следует отметить, что только описанная аллореактивная система позволяет обнаружить IgE-предшест- венники, которые встречаются с низкой частотой Lanzavecchia Parodi, 1984. Условия, которые необходимы для активации В-клеток посредством аллореактивных клонов, заслуживают особого внимания. В тех культурах, в которых Т-хелперный клон активируется соответствующим облученным стимулятором, для активации большинства В-клеток не требуется ни связывания антигена, ни взаимодействия с Т-хелперным клоном Lanzavec- chia, 1983. Следовательно, активация В-клеток, которую не удается получить в бесклеточной культуральной среде от активированных хелперных клонов, вероятно, опосредуется локальной продукцией неспецифических факторов роста и созревания В-клеток. Таким образом, главное ограничение настоящей системы поликлональной активации В-клеток, а именно узкая специфичность Т-клеточных клонов, может быть преодолено. При условии доступности Т-хелперного клона и соответствующих клеток-стимуляторов можно без ограничений активировать любой источник В-клеток. Сходная хелперная система с неограниченными возможностями может быть в принципе получена при добавлении.

Компания Экострой-комплекс: строительство домов. Бригада профессионалов.

К носитело добавляют 2 мл раствора

Если исследователь заинтересован в анализе РНК, образуемой трансформантами, содержащими вектор с последовательностями плазмиды pBR322, не следует пользоваться зондами, которые содержат pBR322. Многие трансформанты образуют РНК, которая содержит последовательности плазмиды pBR322, и в результате могут быть получены ошибочные данные. Недавно было описано много новых методов для получения стабильного переноса генов использование векторов на основе ретровирусов Shimotohno, Temin, 1981, слияние с липосомами Schaefer-Ridder et al.1982, слияние с мембранами эритроцитов Wiberg et al.1983, метод мембранного укола Yamamoto et al.1981, электрический шок Neumann et al.1982 и прямая микроинъекция ДНК Capecchi, 1980. Как отмечалось ранее, многие лимфоидные линии не удается трансформировать с помощью слияния с протопластами бактерий. В таких случаях можно попытаться использовать другую методику. Разработка технологии получения рекомбинантных ДНК необычайно расширила наше понимание проблемы структуры и функции генов. В большинстве успешных методов клонирования генов важное место занимает клонирование кДНК, поскольку 1 кДНК представляет собой инструмент для последующего скрининга геномных библиотек с целью выделения гена, которому она соответствует, и 2 кДНК соответствует структуре зрелой мРНК, в то время как данный ген содержит в своей структуре интроны по крайней мере в большинстве случаев. Кроме того, поскольку кДНК представляет собой непосредственный продукт зрелой мРНК, можно с помощью кДНК синтезировать полипептиды, кодируемые соответствующей мРНК- Это открывает возможность получения редких белков с помощью биотехнологии для их последующего анализа или практического использования. В настоящее время довольно трудно найти для клонирования новую кДНК, поскольку большинство кДНК, которые легко клонируются, уже проклонированы. Имеющие биологический интерес мРНК, которые не были проклонированы, содержатся в очень малых количествах, и поэтому данные об аминокислотных последовательностях и других свойствах белков, которые они кодируют, довольно скудны. В связи с этим единственным способом для выделения кДНК-клона, соответствующего данной мРНК, является биологическое определение соответствующего белка или его детектирование с помощью антител. Оба эти метода скрининга могут использоваться в рамках процедуры, включающей следующие этапы 1 гибридизацию, 2 выделение мРНК, соответствующей кДНК, и 3 микроинъекцию выделенной мРНК в ооциты шпорцевой лягушки. Более удобным примером, однако, является экспрессия клонированных кДНК в клетках- хозяевах с образованием активных в биологическом или антигенном отношении продуктов.

Открытие бизнеса в Казахстане