Архив рубрики «Методы»

Разработка эффективной схемы

При нагревании над открытым пламенем раствор агара можно приготовить быстрее, однако это следует делать осторожно, непрерывно вращая сосуд с раствором, чтобы агар расплавлялся полностью доводить до кипения трижды, а потери материала из-за выкипания были минимальными. В обоих случаях рекомендуется использовать склянки с неплотно закрытыми крышками. Как показали Кинкейд и др. Kincade et al.1976, в агаре присутствуют митогены, необходимые для пролиферации В-клеток в полужидкой среде. Другие полужидкие среды на основе метилцеллюлозы или агарозы проявляют митогенный эффект только при добавлении к ним экстракта агара. Мы не нашли больших отличий в способности разных партий агара поддерживать рост колоний В-клеток или колоний, возникающих из предшественников В-клеток, но обнаружили зависящие от партии агара небольшие вариации в консистенции образующегося агарового геля. Это несущественно для выявления колоний с помощью стереомикроскопа, но может создавать большие неудобства при переносе агарового геля на предметное стекло — процедуре, необходимой в ходе анализа секреции антител колониями В-клеток Paige, Skar- vall, 1982. Поскольку митогенные свойства агара определяются концентрацией полианионных полисахаридов, а консистенция геля зависит от содержания несульфатированной 3,6-анги- дро-галактозы, неудивительно, что эти параметры могут варьировать независимо. В нашей практике мы столкнулись с тем, что из четырех партий агара одна оказалась непригодной для опытов с переносом геля на предметные стекла. Для достижения конечного результата — получения полужидкого геля из 0,3-ного агара, содержащего известное число диспергированных в нем клеток, — могут быть использованы различные способы. Выбор конкретного способа зависит как от замысла и масштабности опыта, так и от технических возможностей экспериментатора. Обычно среду разливают аликвотами по 10-50 мл и оставляют их при 37 С в водяной бане. Расплавленный агар добавляют до конечного разведения 1 10. После смешивания среды и агара добавляют клетки, суспензию перемешивают и разливают по пластиковым чашкам Петри диаметр 35 мм, содержащим нижний слой агара. Если готовят 50 чашек, содержащих идентичный верхний слой агара, то удобнее всего добавить необходимое число клеток к 50 мл содержащей агар среды, перемешать суспензию и разлить ее по чашкам.

Уже просто не хватает фантазии писать анкоры по ключевому слову продвижение сайтов. Надо пойти заказать у копирайтера.

При получении гибридов

Мы работаем с одной и той же смесью амфолинов с 1983 г. и получаем в основном удовлетворительные результаты рис. 11-13. Для некоторых образцов, по-видимому, может не хватать буферной емкости солюбилизирующего буфера, и в результате может происходить наложение пятен в отдельных участках гелей или сдвиг всей картины разделения к кислому или щелочному концу геля. Белки, присутствующие в разделяемом материале в больших количествах, хорошо фракционируются в первом направлении, но начинают выходить из столбика геля при переносе в уравновешивающий буфер. Диффузия белка из геля продолжается при разделении во втором направлении, из-за чего белок может расползаться вдоль столбика, а затем перемещаться во втором направлении в виде горизонтальной полосы. Этого можно избежать, промывая столбик геля перед его нанесением на пластину для разделения во втором направлении. Правда, этот прием эффективен не всегда. Описанный в этой главе метод основывается на том, что клетки гибридом способны включать радиоактивную экзогенную метку в синтезируемые ими белки. Очищенные антитела стабильны и специфически связываются с любой клеткой-мишенью, живой или убитой, если эта клетка несет антигены, узнаваемые данными антителами. Тест связывания антител надежен, достаточно гибок и хорошо воспроизводим. Он позволяет получать количественные данные, причем результаты регистрируются автоматически. Примеры использования этого метода, приведенные в данной главе, полностью относятся к исследованиям ал- лоантигенов мышей, однако подобный подход применим ко всем типам клеток, для которых имеются соответствующие мо- ноклональные антитела. Существует много вариантов детектирования антигенов клеточных поверхностей за счет связывания специфических антител. Ряд этих методов описан в первой книге из серии, редактируемой И.

Отдых на море в Бердянске

Время удвоения

Липосомы содержат не более 507о мембранных белков по массе. Это примерно соответствует составу мембран лимфоцитов. Для получения липосом смешивают липиды и мембранные белки в растворе детергента, а затем детергент удаляют. Поскольку удаление тритона Х-100 диализом — процесс весьма длительный, более предпочтительно его удаление с помощью сорбции на полистирольных гранулах SM2. Они представляют собой гидрофобные частицы, способные к сильной адсорбции молекул детергента Holloway, 1973. Смесь липидов и белков в растворе детергента инкубируют, встряхивая ее с гранулами SM2 до тех пор, пока не сформируются липосомы. К смеси, содержащей 1 мг липидов, 1 мг белков и 10 мг тритона Х-100 в объеме 1 мл, добавляют 0,25 мл буфера для реассоциации и 0,2 мл гранул SM2. Инкубируют смесь при постоянном встряхивании 3 ч при 20 С, а затем удаляют жидкую фазу и добавляют к ней новую порцию 0,2 мл гранул SM2. После еще одной инкубации со встряхиванием в течение 3 ч супернатант должен начать опалесцировать, что указывает на образование липосом. Если белки, выделенные на лентил-лектиновом или иммунном носителе, требуется реассоциировать с липидами после удаления детергента диализом, то необходимо заменить тритон Х-100 на детергент с малым размером мицелл, например на ок- тилглюкозид. Это легче всего сделать в тот момент, когда белки адсорбированы на аффинной колонке. Через колонку пропускают один объем буфера без тритона Х-100, содержащего 4,5 мгмл октилглюкозида. К липидно-детергентной пленке добавляют раствор белка и тщательно перемешивают смесь при комнатной температуре. Смесь переносят в диализный мешочек и диализуют против буфера для реассоциации в течение 18 ч с тремя сменами буфера. На образование липосом указывает появление в липидно-белко- вой смеси опалесценции. Е.

фотошоп скачать бесплатно

Липосомы

Небольшое загрязнение хромосомной ДНК Е. coli обычно не представляет собой проблемы; однако для получения зондов, используемых в опытах по прогулке вдоль хромосомы см. ниже, мы дополнительно очищаем космидную ДНК с помощью центрифугирования в CsCl Maniatis et al.1982. Если скрининг космидной библиотеки проводили с использованием нескольких зондов, то соответствие между разными космидными клонами можно установить с помощью простого метода гибридизации дот-блот Kafatos et al.1979. К 2 мкл каждой из космидных ДНК добавляют 170 мкл 100 мМ трис-HCl, рН 7,4, 30 мкл 2 М NaOH и 100 мкл 20XSSC. Смеси прогревают при 80 С в течение 10 мин для денатурации ДНК и нейтрализуют добавлением 40 мкл 2 М трис-HCl. Каждую пробу разделяют на порции, число которых равно числу использованных для гибридизации зондов, и наносят образцы на нитро- целлюлозный фильтр с использованием фильтрационного устройства например, Minifold, Schleicher, Schiill. Фильтр разрезают таким образом, чтобы каждая полоска содержала набор точек, соответствующих всему набору космидных клонов. Далее каждую полоску гибридизуют индивидуально с одним гибридизационным зондом. В. Рестрикционное картирование Для получения рестрикционной карты космидного клона рестриктазы выбирают таким образом, чтобы нуклеотидная последовательность, которую они узнают, содержала один или два динуклеотида CpG например, Sail, Clal, Smal, Sacll, Xhol, MluI, Nrul, BssHll. Поскольку в эукариотических ДНК дину- клеотиды CpG встречаются довольно редко, в большинстве случаев эти ферменты будут узнавать лишь ограниченное число сайтов во вставке, и поэтому ими легко пользоваться для картирования.

Скрины экрана — если хочешь чтобы тебе помогли в тех. поддержке. Они там все жутко избалованные, словно начитались новостей про музыку.

По пептидному картированию

Типу перевозки грузоперевозки звоните в любое время.

Однако такие гидрофобные белки, как овальбумин, часто элюируются с меньшей эффективностью выход 80. Regnier, 1983. Во многих случаях приемлемыми системами для элюции оказались градиентные растворы ацетонитрила, содержащие ион-парный агент ТФК в концентрации 0,1. ТФК является сильной кислотой и помимо этого обладает целым рядом преимуществ 1 хорошо солюбилизирует белки; 2 относительно слабо поглощает в УФ-области; 3 доступна в очищенном виде; 4 легко удаляется при лиофилизации. Ацетонитрил обладает теми же достоинствами в отношении поглощения, чистоты и летучести и, кроме того, имеет очень низкую вязкость. При разделении белков используются также такие растворители, как 1- и 2-пропанол, несмотря на их более высокую, чем у ацетонитрила, вязкость. Они обладают большей гид- рофобностью, и поэтому в их присутствии белки можно элюиро- вать при меньших концентрациях органических растворителей. Подобно ионообменным колонкам для ВЖХ, колонки для обратнофазовой хроматографии характеризуются высокими емкостями в отношении белка при использовании одних и тех же силикагельных матриц Regnier, 1983. Обычно на аналитическую колонку для обратнофазовой хроматографии размером 4,6 X 250 мм наносят максимум 2-5 мг белка. Однако для белков, сильно отличающихся друг от друга по гидрофобности, таких, как, например, БСА и овальбумин, хорошего разделения достигают и при нагрузках более 10 мг Regnier, 1983. Для крупномасштабных разделений с использованием обратнофазовой хроматографии у фирм-изготовителей можно приобрести в больших количествах матрицы или уже готовые полупрепаративные колонки. Количество белка при ВЖХ на колонках чаще всего определяют по площади соответствующих пиков элюции, полученных при измерении поглощения при 280 или 205 нм. Для этих целей можно использовать автоматический интегратор, однако его применение не обязательно. Количественную информацию можно получить и с помощью интегрирования профиля элюции на ленте самописца.

Бронирование номеров в гостиницах города Кемерово

Безусловная польза от потягивания

Потягиваться приятно потому, что в период сна тело находится лишь в нескольких положениях и после пробуждения мышцы требуют разминки. В данном случае потягивание – это своеобразная зарядка для нашего тела. Она необходима нам, поскольку мышцы долгое время отдыхали, расслаблялись и были в неподвижном состоянии. Таким образом мышцы подготавливаются к повседневной работе, восстанавливает нормальное кровообращение и переводит организм из режима сна в режим активности.
Прочитать остальную часть записи »

Схемы очистки

через 2 схемы очистки тот иВпоследствии были разработаны варианты анализа, позволяющие обнаруживать предшественники эритроцитов Stephenson et al.1971; Axelrad et al.1974, предшественники мегакариоцитов Metcalf et al.1975a, а также предшественники с менее ограниченным потенциалом, способные дифференцироваться при росте в полужидкой среде по нескольким направлениям Johnson, Metcalf, 1977. Сходные методы использовали также и для разработки анализа клонального роста В-клеток Metcalf et al.1975 b, 1976; Kincade et al.1976. Описаны методы клонирования В-клеток в жидкой среде с помощью лимитирующего разведения суспензии или микроманипулирования с клетками, а также на фрагментах селезенки Klinman, 1972; Quintans, Lefkovits, 1974; Andersson et al.1977; Wetzel, Kettman, 1981. Применение этих методов для обнаружения и подсчета предшественников В-клеток встречало большие трудности, прежде всего в силу малочисленности соответствующих лимфоцитов в большинстве популяций. Несмотря на это, клональную диф- ференцировку В-клеток удалось проследить при использовании как лимитирующего разведения и культивирования клеток на фрагментах селезенки, так и полужидких агаровых культур Melchers, 1977 a, b; Klinman et al.1980; Paige, 1983, 1984; Paige et at.1984; Jyonouchi, Kincade, 1983. В этой главе мы рассмотрим применение полужидких агаровых культур для изучения дифференцировки В-лимфоцитов. Система, которую мы использовали, позволяет обнаружить предшественники, которые присутствуют в печени 12-суточного плода, и обеспечивает возможность клональной дифференцировки этих клеток в колонии, содержащие В-лимфоциты, секретирующие антитела. Будет описан также способ обнаружения секретируемых антител либо с помощью локального гемолиза, либо посредством переноса продукта секреции на нитроцеллюлозные фильтры с последующей иммуноидентификацией.

Позитивний блог megafriends.org.ua

Ионообменные носители для ВЖХ

чашки добавляют ионообменные носители для вжх антитела дляТаким образом, улучшенные матрицы, наличие разнообразных колонок и увеличение их емкостей дают возможность исследователям в области иммунохимии использовать присущие ВЖХ высокую чувствительность, хорошее разрешение и быструю элюцию. В этой главе будут детально обсуждены три типа хроматографических разделений, используемых в нашей лаборатории для очистки иммуноглобулинов изучения их структуры. Речь пойдет о методах ГП-ВЖХ, ОФ-ВЖХ и ГА-ВЖХ. Разделение молекул при жидкостной хроматографии достигается за счет их распределения между подвижной фазой растворителем и стационарной фазой матрицей колонки. Если молекулы вещества X в большей степени связываются с матрицей, чем молекулы вещества Y, то вещество Y будет элюиро- ваться с колонки раньше, чем вещество X. В случае гель-прони- кающей хроматографии ГПХ стационарная фаза представляет собой пористые гранулы. Здесь разделение молекул достигается за счет того, что поры дифференциально замедляют движение веществ в колонке. Некоторые низкомолекулярные вещества полностью входят в поры гранул носителя, другие, более крупные, входят только частично или совсем не входят. Молекула Б, более крупная, чем молекула А, будет элюироваться с колонки раньше, чем молекула А. Все молекулы, которые не входят в поры гранул носителя, сойдут с колонки в той порции элюата, которая называется исключенным или свободным объемом Vo. Все другие молекулы будут элюироваться с колонки в зависимости от их размера. Самые маленькие молекулы, способные входить в поры носителя без какого-либо взаимодействия с ним, элюируются объемом растворителя, который называют полным объемом Vt. Другие варианты жидкостной хроматографии также основаны на различиях в равновесных распределениях разделяемых молекул между стационарной и подвижной фазами. В случаеобратнофазовой жидкостной хроматографии ОФХ стационарной фазой является твердый носитель с пришитой органической неполярной группой. Вещества связываются с носителем благодаря сродству к этим неполярным группам. Таким образом, здесь степень связывания фракционируемых веществ с носителем обусловлена их гидрофобными свойствами. Обычно пришивают линейные алкильные углеводородные цепи, хотя иногда используются и фенильные, и дифенильные группы.

Обеспечат надёжную защиту любого жилища разнообразные клинские металлические двери с кодовым замком и фотоэлементом имеющие большой срок эксплуатации.

D ALT-кассеты

здесь метод d alt-кассетыПосле того как фильтр для получения реплики пришел в контакт с исходным фильтром, их нельзя сдвигать относительно друг друга. Полученный сэндвич накрывают стерильной бумагой Whatman 3 ММ и сдавливают большой пластмассовой коробкой с плоским дном. Верхнюю бумагу Whatman 3 ММ выбрасывают иглой для шприца 20 GIV2, содержащей тушь, маркируют фильтры, делая в них 10 отверстий 3 внизу, 3 в середине, 3 вверху и одно в левом верхнем углу. Фильтры осторожно отделяют друг от друга и опять помещают в чашки с агаром L-амп колониями вверх. Фильтр, использованный для получения реплики, кладут в свою чашку, в то время как исходный фильтр помещают в чашку со свежим агаром L-амп. Исходный фильтр инкубируют 1-2 ч при 37 С, после чего аналогичным образом получают вторую реплику. Маркирование отверстия исходного фильтра переносят на вторую реплику с помощью иглы. После получения второй реплики исходный фильтр помещают в чашку со средой HMF-1 амп. С каждого исходного фильтра необходимо получить по три реплики. Третий набор фильтров с репликами инкубируют в чашках со средой HMF-1 амп. Наконец, четвертый фильтр с репликой используют фильтры, смоченные в чашках со средой HMF-1 амп готовят для каждого из исходных фильтров. Два последние фильтра, однако, не отделяют друг от друга, а замораживают в виде сэндвича Hanahan, Meselson, 1983. Сэндвич, обернутый листами бумаги Whatman 3 ММ, смоченными водой, кладут в полиэтиленовый мешочек, который заплавляют и замораживают при -70 С. Три фильтра-реплики, полученные от каждого исходного фильтра два набора на агаре L-амп, один на агаре HMF-1 амп, подращивают при 37С до тех пор, пока диаметр колоний не станет равным 1 мм. Первые два набора используют для скрининга библиотеки с помощью гибридизации см. ниже, в то время как третий набор, инкубированный в чашках с агаром HMF-1 амп, переносят в чашки с агаром HMF-2 амп и оставляют на 2 ч при комнатной температуре.

Все знают курорт Белокуриху как уникальный по свойствам курорт Сибири.

С использованием обычных носителей

В соответствии с типом В-клеточного ответа, который должен быть проанализирован, хелперный тест может быть проведен различными способами. Обычно собирают Т- клетки из ИЛ-2-зависимых культур, трижды промывают их и культивируют с неким источником В-клеток либо с МПК, либо с не-Т-клетками, В этой системе присутствие Т-клеток в препаратах В-клеток не оказывает влияния на степень В-клеточной активации, поскольку такие Т-клетки, будучи аутологичными по отношению к отвечающим В-клеткам, не являются цитотоксическими. Для скрининга рекомендуется культивировать различные количества клонированных Т-клеток от 2-104 до 1,25-103 с мпк 105 или не-Т-клетками 3-104 в 200 мкл RPMI — спк в лунках плоскодонных микропанелей. В качестве контроля используют культуры, содержащие только Т-клетки, и культуры, содержащие только мпк. Число В-клеток с цитоплазма- тическим иммуноглобулином можно измерить через 6 сут с помощью иммунофлуоресценции, а количество секретируемого иммуноглобулина в среде — через 8 сут с помощью иммунофер- ментного анализа ELISA. В описанных выше условиях оптимальная стимуляция В-клеток происходит только при использовании 5-10-Ю3 Т-клеток, в результате чего образуется 100-300 мкг иммуноглобулина на 1 мл среды. Частоту встречаемости В-клеток, активированных к выработке данного изотипа антител, можно определить с помощью метода лимитирующих разведений МЛР см. обзор Lefcovits, Waldmann, 1979. Обычно культивируют различное число В-клеток в том интервале, в котором это число лимитирует исследуемый ответ в нескольких 24-60 параллельных опытах с постоянным числом Т-хелперных клеток и облученных клеток-стимуляторов. Тип системы с лимитирующим разведением и число культивируемых клеток зависят от частоты встречаемости исследуемых В-клеток. Культивирование можно проводить в лунках панелей Терасаки в объеме 20 мкл, содержащем Ю3 Т-клеток и 104 облученных МПК, используемых как стимуляторы; число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 100 на лунку. При более низкой частоте встречаемости отвечающих В-клеток культивирование можно проводить в лунках с V-образным дном 96-луночных панелей, содержащих по 104 Т-клеток и 5-Ю4 МПК в 200 мкл RPMI — СПК на лунку; число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 104 на лунку. В нашей лаборатории мы на протяжении трех последних лет воспроизводимо получаем аллореактивные Т-хелперные клоны, используя различные аллогенные клонированные СКЛ. Большая часть полученных клонов обычно более чем 50 имела свойства Т-хелперных клеток, судя по тому, что такие клоны пролиферировали в ответ на первоначальный стимулятор в отсутствие экзогенного ИЛ-2 и проявляли хелперные функции как по отношению к В-клеткам, так и по отношению к цитоток- сическим предшественникам Lanzavecchia, 1983; Ramarli et al.1984. Нужно отметить, что некоторые цитотоксические клоны могут пролиферировать и вырабатывать ИЛ-2 в тех же самых условиях рестимуляции, что и Т-хелперы. Вместе с тем между индивидуальными клонами были обнаружены количественные различия как в отношении ростового потенциала, так и в отношении хелперных свойств. Следовательно, для получения достоверных результатов необходим широкий скрининг и титрование хелперных клеток.

Купить стоковые фото