Архив рубрики «Методы»

Слияния клеток

IV, Б, 2 с клетками BW5147, обладают специфической цитолитической активностью, однако у большинства гибридов эта активность была ниже, чем цитоли- тическая активность родительского клона ЦТЛ. Культуры, обладающие высокой специфической цитолитической активностью, клонируют в CS-среде. В каждую лунку панелей для микротитрования вносят в среднем одну гибридную клетку и 2- Ю4 облученных рентгеном 2000 Р перитоне- альных клеток в 200 мкл CS-среды. -Перитонеальные клетки получают промыванием CP брюшной полости сингенных или аллогенных мышей. По достижении конфлюентности клоны переносят в лунку Costar 3524, наращивают клетки в CS-среде и проверяют их на цитолитическую активность. Клоны, обладающие высокой цитолитической активностью, культивируют в CS-среде и обычно повторно клонируют несколько раз, для того чтобы отобрать клоны со стабильной экспрессией цитолитической активности. Повторное клонирование обычно проводят в CS-среде без каких-либо фидерных питающих клеток. Модификация известного метода Fogh, Fogh, 1964 была введена в практику нашей лаборатории д-ром Стокером. В лунки панели Costar 3524 вносили по 4-104 клеток HeLa в 1 мл среды и 1 мл среды, кондиционированной клетками тестируемых линий, или 1 мл среды, подлежащей проверке. Через 2-3 дня инкубации клетки HeLa фиксировали. После отсасывания среды в лунки наливали 750 мкл 0,6-ного цитрата. Для того чтобы вызвать гипотоническое набухание, по каплям добавляли 250 мкл дистиллированной воды и через 5 мин 1 мл свежеприготовленного фиксатора Карнуа 25 ледяной уксусной кислоты и 75 этанола. Затем жидкость из лунок отсасывали и добавляли 500 мкл свежего фиксатора. Через 10 мин удаляли фиксатор и пробы полностью высушивали. Для окрашивания ДНК добавляли двусолянокислый хинакрин 0,01-ный раствор в дистиллированной воде. Через 10 мин лунки высушивали, вырезали донышки, помещали их на предметное стекло и просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа при стократном увеличении.

фильм пираты карибского моря, странный берега.

Вату наносят на колонку

Чем меньше размер частиц, тем меньше значение Н и тем выше разрешение. Однако, чтобы сохранить скорость потока подвижной фазы при уменьшении размера частиц, требуется повышение давления, причем с увеличением скорости потока подвижной фазы такое повышение должно возрастать. Использование пористых частиц позволяет снизить давление подачи элюента, но при этом одновременно снизится эффективность колонки. В общем между степенью пористости носителя и эффективностью фракционирования можно найти оптимальное соотношение, при котором достигается эффективное и быстрое разделение. Более подробно эти факторы обсуждают Снай- дер и Керклэнд Snyder, Kirkland, 1979. Как было отмечено выше, для ВЖХ белков разработаны новые типы матриц, которые позволили устранить многие негативные факторы при хроматографии. Первой существенной модификацией, которая привела к значительным положительным эффектам, было улучшение покрытия матриц требуемым адсорбирующим компонентом, например алкильными группами в случае ОФ-ВЖХ, а также блокировка остальных свободных си- ланольных групп низкомолекулярными модифицирующими алкильными группами. Эту модификацию называют еще блокировкой концов. Большинство матриц для ВЖХ делают на основе силикагеля или органических полимеров. В случае сили- кагельных носителей большие трудности возникали из-за веществ, которые практически необратимо связывались со свободными силанольными группами, не заблокированными после пришивки алкильных групп. Вероятность такого связывания особенно велика для белков. Их десорбция при последующих разделениях может приводить к загрязнению препаратов. Благодаря усовершенствованию методов модификации матриц и модификации свободных силанольных групп негативное влияние неспецифической адсорбции на матрицах для ВЖХ было значительно уменьшено. В настоящее время разнообразие оборудования для ВЖХ белков столь огромно, что описать его детально невозможно.

секс

Флуорохромы

1983; Pirotta et al.1983. Целесообразно проверять данные опытов по прогулке вдоль хромосомы, сравнивая изолированные космидные клоны и геномные ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Это легко выполнимо для клонов, выделенных из МНС ДНК мыши при использовании большого числа конгенных и реком- бинантных конгенных линий мыши Klein et al.1983. Выделенный из клона однокопийный зонд, используемый для прогулки вдоль хромосомы, применим также для выявления полиморфизма по сайтам рестрикции двух инбредных линий мышей. Конгенные или конгенные рекомбинантные линии мышей, содержащие гены МНС или части этого комплекса одной линии мышей, а все другие гены — другой, могут быть подвергнуты анализу для выяснения происхождения клонированной последовательности Steinmetz et al.1982b. При скрининге космидных библиотек с использованием различных зондов в ряде случаев было обнаружено, что определенные последовательности представлены недостаточно Steinmetz et al.1982b. Интересно, что это явление было отмечено для самых разных инбредных штаммов мышей М. Steinmetz, неопубликованные данные. При его объяснении обсуждаются две проблемы. Во-первых, участки, узнаваемые рестриктазами Sau3A или МЬо т. е. ферментами, используемыми для частичного гидролиза эукариотической ДНК, могут быть распределены не случайным образом, а так, что определенные последовательности оказываются расположенными на фрагментах ДНК, слишком крупных или слишком мелких для клонирования. Во-вторых, эффективность репликации в Е. coli эукариоти- ческих ДНК-последовательностей может снижаться из-за их модификаций.

Надежная и компактная husqvarna 236 помогла решить мне кучу проблем по двору и стала прекрасным помощником на даче.

Для экспрессии кДНК

для экспрессии кднк гидролиз десятиНачинают с фильтров 1 и 2 на первом листе бумаги и помещают фильтры 2 и 1 в указанном порядке на второй лист и т. д. Это позволит легко идентифицировать положительные колонии, в том числе и в тех областях, где фильтры перекрываются друг с другом. На бумагу Whatman 3 ММ в нескольких местах наносят метку с помощью радиоактивных чернил или маркера для радиоавтографии Ultemit NEN и нумеруют их номерами от 1 до 10. Фильтры закрывают пленкой Saran и прикрепляют ее к бумаге рядом с фильтрами, чтобы они не двигались. Для радиоавтографии применяют пленку Kodak X-Omat R. Экспозицию проводят в течение ночи при -70 С с использованием усиливающих экранов например, Ilford, быстрый вольфрамат- ный. На кассете отмечают дату проявления. Перед проявлением кассетам дают возможность прогреться до комнатной температуры, удаляют усиливающий экран и пленку и закрывают кассету, чтобы избежать какого бы то ни было движения фильтров на бумаге Whatman 3 ММ. После идентификации положительных колоний см. ниже фильтры хранят при -70 С в картонной коробке, а для дальнейшей работы используют проявленную пленку разд. IV, Б. Для того чтобы идентифицировать положительные сигналы, после того как фильтр совмещен с бумагой 3 ММ в соответствии с метками, нанесенными радиоактивными чернилами используют просвечивающий осветитель, маркирующие точки с фильтра переносят на пленку. Положительные гибридизацион- ные сигналы должны присутствовать на обеих репликах, полученных с одного и того же исходного фильтра, что позволяет легко отличить их от ложных радиоактивных сигналов, обусловленных фоновой гибридизацией.

флеш игры

Все позитивные культуры

Поскольку большинство белков, упоминаемых в литературе, имеют значения pl8 Righetti et al.1981, анионообменники применяют более широко, чем катионообменники Gupta et al.1983. Как и в других случаях, при разделении крупных белков критическим фактором является размер пор ионообменника. Показано, что анионообменники с размером пор до 4000 А применимы для хроматографии белков, имеющих мол. массу 200 000-400 000 Regnier, 1983. Раньше отдавали предпочтение слабым ионообменникам, но теперь показано, что сильный анионообменник Mono Q зарегистрированная торговая марка фирмы Pharmacia и сильный катионообменник Mono S зарегистрированная торговая марка фирмы Pharmacia обладают рядом преимуществ. Они характеризуются более высокой разрешающей способностью, более легко прогнозируемым временем задержки веществ и лучшим выходом белков, чем использовавшиеся ранее матрицы на основе силикагеля Kopaciewicz, Regnier, 1983. Эти новые анионообменники созданы на основе гидрофильной полиэфирной смолы Richey, 1982 имеют дополнительное преимущество они устойчивы в широком диапазоне рН 2-12. Силика- гельные матрицы используются только при рН 8, при больших значениях рН силикагель растворим. Хотя при обратнофазовой в обращенных фазах ВЖХ белков необходимо использование денатурирующих растворов с низким рН и органических растворителей в высоких концентрациях, она приобрела в последние годы большую популярность. Основные достижения в этой области рассмотрены в специальных обзорах Alvarez et al.1981; Regnier, 1983. При работе с некоторыми недавно созданными матрицами для ВЖХ на основе силикагеля могут использоваться мягкие условия элюции, приближающиеся к тем, которые применяются для разделений по гидрофобным свойствам на обычных носителях Kato et al.1983; Fausnaugh et al.1984; Gooding et al.

Партнерские программы для заработка

После центрифугирования

Фильтры Millipore помещают в чашки Петри со средой L-амп Falcon, 1058, диаметр 15 см; число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. Из каждой клеточной суспензии делают разведения 102, 10_3 и Ю-4 на среде L-амп по 1 мл каждого. По 200 мкл каждого разведения наносят на з площади фильтра Grosveld et al.1981, начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Millipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий обычно около 6 ч при 37 С клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 С используют для последующего отбора положительных колоний. Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее разд. IV, А. Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга разд. IV, Б, который прогревают 10- 15 мин при 70 С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию разд.

Строительные бригады

В описанный метод

Если объем ДНК превышает 2 мл, то ее осаждают этанолом Maniatis et al.1982 и вновь растворяют в ТЭ-буфере 2 мл в течение ночи. После центрифугирования из пробирок с помощью насоса медленно отбирают фракции по 0,7 мл собирают около 30 фракций с помощью коллектора. По 10 мкл каждой из фракций 1-17 анализируют в 0,3-ном агарозном геле вместе с маркерными фрагментами ДНК фага К, которые наносят на среднюю и крайние дорожки геля. К маркерным фрагментам добавляют по 10 мкл 40-ного раствора сахарозы, чтобы концентрация сахарозы и солей в них была такой же, как и в пробах. Длительность электрофореза составляет 16 ч при 40 В. Фракции, содержащие фрагменты ДНК размером от 30 до 50 kb, объединяют фракции, содержащие фрагменты ДНК размером 30 kb отбрасывают и осаждают 2,5 объемами этанола соль дополнительно не добавляют. Материал перемешивают и оставляют при -25 С на ночь. На следующий день пробирки нагревают до комнатной температуры для того чтобы растворить сахарозу, если она выпала в осадок и собирают ДНК центрифугированием. Если общий объем составляет 10 мл, то ДНК осаждают в полиалломерной пробирке ротора SW27. Чтобы пробирка не разрушилась при центрифугировании, ее заполняют доверху 70-ным этанолом. Длительность центрифу- Представленная ниже пропись относится к космидному вектору pNNL Brosveld et al.1982, содержащему ген Eco-gpt, облегчающий перенос клонированных генов в эукариотические клетки. Эту пропись с соответствующими модификациями можно применить и в случае других космидных векторов. Одну аликвоту ДНК вектора pNNL 20 мкг гидролизуют рестрикта- зой Нра, а другую такую же — рестриктазой Clal. Добавляют по 20 ед. каждого фермента инкубируют 4 ч при 37 С.

В любое время Вы можете при желании пойти в институт бизнеса и политики, чтобы получить второе высшее образование, которое на сегодня считается престижным.

К клеткам добавляют по каплям

тот и к клеткам добавляют по каплям 1982Тонкослойная хроматография ТСХ на покрытых слоем си- ликагеля пластинах является весьма эффективным методом анализа сложных смесей липидов. Проходящий через носитель элю- ент переносит отдельные липиды с разной скоростью в зависимости от их полярности, в результате чего липидные компоненты оказываются на разных расстояниях от места нанесения. Неполярные нейтральные липиды перемещаются почти с фронтом растворителя, в то время как полярные липиды задерживаются в соответствии с увеличением заряда и степени полярности. Соответствующие липидам фракции можно увидеть после обработки пластины парами йода или опрыскивания специальными окрашивающими реагентами. Для изучения гликолипидных антигенов чрезвычайно полезным оказался впервые описанный Маньяни и соавторами Mag- nani et al.1980 элегантный метод, представляющий собой комбинацию ТСХ и РИА. При использовании этого метода хро- матограмму сначала инкубируют с моноклональными антителами, а затем с меченными 1251 антителами против IgG мыши. Обладающие антигенной активностью липиды выявляют с помощью радиоавтографии отмытой и высушенной хроматограм- мы рис. 9-3. В сходном методе Towb, in et al.1984 липиды переносят блоттингом с хроматограммы на нитроцеллюлозный фильтр, который затем обрабатывают антителами таким же образом. С помощью этого метода можно выявлять антигены в количестве до нескольких нанограммов, т. е. его чувствительность на два порядка выше чувствительности, достигаемой при химическом детектировании с использованием паров иода и красящих реагентов. Не все виды покрытых силикагелем пластин для ТСХ одинаково пригодны для иммунологического выявления липидов.

денежный мешок

Липосомы содержащие мембранные белки

Другой подход заключается в использовании векторов на основе ретровирусов, которые дают высокую эффективность трансформации интеграции ДНК в хромосомы. В этом случае необходимо решить проблему, как можно после идентификации клона повторно вырезать интегрированную кДНК из ДНК клетки и амплифицировать. Успехи, достигнутые на протяжении последних лет в области генетической инженерии и методов переноса генов, дали возможность непосредственно решать многочисленные вопросы, касающиеся экспрессии генов и регуляции их активности. Гены высокоспециализированных клеток, таких как клетки В-лимфо- цитарного направления дифференцировки, были перенесены в нелимфоидные клеточные линии для изучения тканеспецифиче- ских контрольных элементов на уровне ДНК Banerji et al.1983; Gillies et al.1983. Путем микроинъекции генов, кодирующих немодифициро- ванные легкие цепи иммуноглобулинов Briuster et al.1983, или путем введения искусственных конструкций, содержащих полные функциональные гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов Rusconi, Kohler, 1985, были получены трансгенные мыши. Исследования на таких мышах дали ценную информацию в отношении перестройки иммуноглобу- линовых генов, механизмов активации и эффектов обратной связи во время дифференцировки В-клеток в присутствии функционально перестроенного полного гена иммуноглобулина. Гены, модифицированные in vitro и вносимые в определенные клеточные линии, дают возможность нового подхода к изучению определенного клеточного продукта на разных стадиях, начиная от перестройки или активации транскрипции и кончая последними этапами, а также многочисленными стадиями про- цессинга между ними. На протяжении последних нескольких лет методы генетической инженерии значительно упростились и в настоящее время широкодоступны. В данной главе мы остановимся на нескольких основных процедурах. После ознакомления с ними будет нетрудно использовать описанные здесь методы для изучения новых систем. Векторы, используемые для клеточной трансформации, представляют собой плазмиды, которые помимо участка начала репликации содержат один ген резистентности, применяющийся для селекции в клетках прокариот, и второй ген резистентности, который может использоваться для селекции в эукариотических клетках. Такие векторы имеют также несколько сайтов рестрикции, по которым и проводят клонирование нужного гена. Ряд векторов, обладающих этими свойствами, показан на рис.

Ищете специалистов по строительству бани хамам ? Компания «А-Строй» выполнит работы качественно и в срок! Выполняем проектирование, строительство и комплектацию хаммамов.+7 495-601-73-01.

Все описанные выше варианты

ДНК вновь растворяют в 50 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, и удаляют концевые 5-фосфатные группы с помощью фосфата- зы из кишечника теленка ФКТ Maniatis et al.1982. В пробу с конечным объемом 100 мкл добавляют 0,75 ед. ФКТ Boeh- ringer инкубируют ее при 37 С 30 мин. Затем добавляют еще 0,75 ед. ФКТ инкубируют еще 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 80 мкл Н20, 20 мкл ЮхТНЭ-буфера 100 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 М NaCl, 10 мМ ЭДТА и 10 мкл 10-ного ДСН. Прогревают пробы при 68 С в течение 15 мин, проводят дважды экстракцию фенолом и дважды севагом. Экстрагируют все фенольные фазы и фазы севага одной порцией ТЭ-буфера объемом 100 мкл, водные фазы объединяют, добавляют ю объема 20 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2, и осаждают этанолом. Осадок промывают 70-ным этанолом, высушивают Speed Vac и растворяют в 150 мкл ТЭ-буфера. Отбирают 0,25 мкг ДНК 1 мкл и проверяют полноту дефосфорилирова- ния в реакции лигирования фрагментов. Добавляют 7 мкл Н20, 1 мкл 10-кратного буфера для лигирования, 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Смесь инкубируют 1 ч при 15 С и анализируют в 0,6-ном мини-геле вместе с 1 мкл нелигированных векторных фрагментов контрольной смесью, например, фрагментами Pstl из плазмиды pBR322 и маркерными фрагментами ДНК фага К. Если дефосфорилирование прошло полностью, то векторные фрагменты гидролизуют рестриктазой BamUl 160 ед. 1 ч при 37 С. Реакцию останавливают, перенося пробирку в лед, и полноту гидролиза 0,25 мкг проверяют в 0,6-ном агарозном мини-геле. Затем пробу один раз экстрагируют фенолом и один раз севагом. ДНК осаждают из водной фазы этанолом, промывают 70-ным этанолом, высушивают в концентраторе Speed Vac и осадок растворяют в 50 мкл ТЭ-буфера ДНК 800 мкгмл.

Организация бронницкий ювелирный завод Ювелир.