Перед проявлением кассетам

перед проявлением кассетамТакой подход дает возможность выявить исключить многие белки, которые являются общими для всех типов лимфоцитов, а также значительно облегчает идентификацию белков, специфичных для определенных стадий дифференцировки, так как карты двумерного электрофореза получают при анализе клонированных популяций, замороженных на определенной стадии процесса дифференцировки. Используя этот подход, мы можем с большей вероятностью идентифицировать белковые маркеры, которые в обычных условиях экспрессиру- ются на немногочисленных субпопуляциях лимфоцитов. Для получения максимального разрешения биосинтетически меченные лизаты клеток анализировали, применяя два различных метода разделения белков. Хотя оба метода включают фракционирование белков в первом направлении по заряду, при одном из них изоэлектрическом фокусировании, ИЭФ белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками pi, а при другом неравновесном электрофорезе в градиенте рН, НЭГрН в соответствии с их подвижностью в градиенте рН. При НЭГрН время электрофоретического разделения не достаточно для того, чтобы белки достигли своих значений pi. Поэтому разделение зависит как от суммарного электрического заряда, так и от размера белковой молекулы. Из нашего опыта следует, что НЭГрН дает лучшее разрешение для интересующего нас класса белков. На рис. 10-2 приведены примеры разделения тем и другим методом при исследовании одного и того же меченного 35S клеточного лизата. Анализ, проводимый для идентификации белков — кандидатов на роль стадиеспецифических маркеров, включает двух- этапный отбор данных в соответствии с избранными критериями. Во-первых, белковые карты каждой В-клеточной линии сопоставляют с белковыми картами Т-клеточных лимфом, список которых приведен в табл. 10-1, и выделяют белки, характерные только для В-лимфоцитов. В принципе эти различия выражаются в абсолютном отсутствии соответствующих фракций на электрофореграммах Т-клеток. Возможны и количественные различия в экспрессии белков, которые можно выявить, если имеется разница примерно в пять или более раз. После выявления специфических для В-клеток кандидатов на роль маркеров проводят сопоставление белковых профилей пре-В и плазматических клеток и дальнейший поиск маркеров стадий дифференцировки. Подобный анчлиз позволяет идентифициро- Для того чтобы убедиться в том, что эти молекулы являются наружными мембранными белками, необходимы дальнейшие эксперименты. С этой целью готовят препараты плазматических мембран из целых клеток, предварительно меченных тотально 35Б-метионином или меченных по поверхности клеток 12SI с помощью реагента 1ос1о?ел Fraker, Speck, 1978. Меченые белки анализируют методом двумерного гель-электрофореза и элект- рофореграммы поверхностных белков сопоставляют с аналогичными электрофореграммами, полученными для тотальных клеточных лизатов, как описано выше.

Виноградная диета

Оставить комментарий