С использованием обычных носителей

В соответствии с типом В-клеточного ответа, который должен быть проанализирован, хелперный тест может быть проведен различными способами. Обычно собирают Т- клетки из ИЛ-2-зависимых культур, трижды промывают их и культивируют с неким источником В-клеток либо с МПК, либо с не-Т-клетками, В этой системе присутствие Т-клеток в препаратах В-клеток не оказывает влияния на степень В-клеточной активации, поскольку такие Т-клетки, будучи аутологичными по отношению к отвечающим В-клеткам, не являются цитотоксическими. Для скрининга рекомендуется культивировать различные количества клонированных Т-клеток от 2-104 до 1,25-103 с мпк 105 или не-Т-клетками 3-104 в 200 мкл RPMI — спк в лунках плоскодонных микропанелей. В качестве контроля используют культуры, содержащие только Т-клетки, и культуры, содержащие только мпк. Число В-клеток с цитоплазма- тическим иммуноглобулином можно измерить через 6 сут с помощью иммунофлуоресценции, а количество секретируемого иммуноглобулина в среде — через 8 сут с помощью иммунофер- ментного анализа ELISA. В описанных выше условиях оптимальная стимуляция В-клеток происходит только при использовании 5-10-Ю3 Т-клеток, в результате чего образуется 100-300 мкг иммуноглобулина на 1 мл среды. Частоту встречаемости В-клеток, активированных к выработке данного изотипа антител, можно определить с помощью метода лимитирующих разведений МЛР см. обзор Lefcovits, Waldmann, 1979. Обычно культивируют различное число В-клеток в том интервале, в котором это число лимитирует исследуемый ответ в нескольких 24-60 параллельных опытах с постоянным числом Т-хелперных клеток и облученных клеток-стимуляторов. Тип системы с лимитирующим разведением и число культивируемых клеток зависят от частоты встречаемости исследуемых В-клеток. Культивирование можно проводить в лунках панелей Терасаки в объеме 20 мкл, содержащем Ю3 Т-клеток и 104 облученных МПК, используемых как стимуляторы; число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 100 на лунку. При более низкой частоте встречаемости отвечающих В-клеток культивирование можно проводить в лунках с V-образным дном 96-луночных панелей, содержащих по 104 Т-клеток и 5-Ю4 МПК в 200 мкл RPMI — СПК на лунку; число отвечающих В-клеток может варьировать от 1 до 104 на лунку. В нашей лаборатории мы на протяжении трех последних лет воспроизводимо получаем аллореактивные Т-хелперные клоны, используя различные аллогенные клонированные СКЛ. Большая часть полученных клонов обычно более чем 50 имела свойства Т-хелперных клеток, судя по тому, что такие клоны пролиферировали в ответ на первоначальный стимулятор в отсутствие экзогенного ИЛ-2 и проявляли хелперные функции как по отношению к В-клеткам, так и по отношению к цитоток- сическим предшественникам Lanzavecchia, 1983; Ramarli et al.1984. Нужно отметить, что некоторые цитотоксические клоны могут пролиферировать и вырабатывать ИЛ-2 в тех же самых условиях рестимуляции, что и Т-хелперы. Вместе с тем между индивидуальными клонами были обнаружены количественные различия как в отношении ростового потенциала, так и в отношении хелперных свойств. Следовательно, для получения достоверных результатов необходим широкий скрининг и титрование хелперных клеток.

Купить стоковые фото

Оставить комментарий