Для построения стандартных кривых используют стандартную сыворотку или известное количество очищенного иммуноглобулина. Чувствительность теста составляет 10 нгмл для IgM, IgG и IgA и 0,5 нгмл для IgE. Примесь очищенного иммуноглобулина постороннего изотипа вплоть до концентрации 10 мкгмл в тесте не обнаруживается. Т-клетки, повторно стимулированные во вторичной СКЛ и размноженные в среде GM в течение 1-2 нед, растут в суспензии, состоящей из отдельных клеток, и обладают жизнеспособностью, близкой к 100. Клетки промывают, подсчитывают и клонируют способом лимитирующих разведений в лунках с V-образным дном 96-луночных микропанелей. Каждая лунка содержит 3-Ю4 облученных МПК от того же, что и ранее, донора в 200 мкл среды GM и в среднем по 1 или 0,2 Т-клетки. Для предотвращения высыхания панели заворачивают в пластиковую пленку Saran Wrap, Dow Chemical Co. инкубируют при 37 С. Приблизительно через 2 нед клоны в лунках, содержащих размножающиеся клетки клоны по 104-105 Т-клеток, становятся хорошо заметными под микроскопом. Эффективность клонирования в различных опытах варьирует от 10 до 80. Клетки из каждой положительной лунки переносят индивиду- -ально в лунки 24-луночных панелей вместе с 5-105 облученных МПК, где они размножаются в среде GM до тех пор, пока не образуется количество клеток, достаточное для скрининга. Подобным образом клетки могут быть повторно клонированы при разведении 0,2 клетки на лунку. Клоны аллореактивных хелперных Т-клеток, подобно всем активным Т-клеткам, требуют для размножения in vitro в качестве ростового фактора только ИЛ-2. Способность к ответу на ИЛ-2, однако, со временем падает вследствие обратной регуляции1 down regulation рецепторов для ИЛ-2. Экспрессия рецепторов ИЛ-2 и, следовательно, способность к ответу на этот фактор роста могут быть восстановлены с помощью повторной стимуляции Т-клеток антигеном Meuer et al.1984. Короче говоря, в любой момент жизни ИЛ-2-зависимой культуры, когда проявляется тенденция к снижению скорости роста, в том числе и в тех случаях, когда размножение прекращается, клетки собирают, промывают и 2-105 Т-клеток вновь стимулируют в 2 мл среды RPMI — СПК в лунках 24-луноч С помощью этого теста измеряют способность Т-клеточных клонов пролиферировать в ответ на клетки-стимуляторы в отсутствие экзогенного ИЛ-2.

Устройство бестопливного генератора есть на сайте generator-napryazheniya.ru

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.