Селективной средой служит CS-среда, содержащая гипоксантин Ю-4 М, аминоп- терин 4-Ю-7 М, тимидин 1,6-Ю-5 М и уабаин 1-Ю-3 М. Для предотвращения цитостатического эффекта тимидина добавляют дезоксицитидин до конечной концентрации 2-Ю-5 М Conzelmann et al.1982b. Однако эта предосторожность, по-видимому, необязательна, поскольку все наши гибриды были получены в отсутствие этого вещества. Через 4-5 дней после слияния по 150 мкл среды из каждой лунки заменяют на свежую селективную среду. Обычно в некоторых лунках обнаруживают размножение клеток через 10 сут после слияния, но иногда это происходило позже только через 30 сут. При засеве по 3,6-Ю4 слившихся клеток на лунку размножение, как правило, получают в 10-40 культур. Клетки конфлюентно- го монослоя отделяют от подложки с помощью среды, не содержащей Са2 и Mg разд. III, Д, 4, и переносят в большие по размеру лунки 24-луночных панелей Costar 3524, которые содержат CS-среду с гипоксантином Ю-4 М и тимидином 1,6-Ю-5 М, но без аминоптерина, чтобы свести к минимуму остаточный токсический эффект последнего. Через 3-4 сут клетки конфлюентного монослоя отделяют от подложки и переносят в небольшие пластиковые флаконы на 10 мл в CS-среде без селективных агентов. Фактически все культуры, полученные при слиянии клонов ЦТЛ третьего типа разд. IV, Б, 2 с клетками BW5147, обладают специфической цитолитической активностью, однако у большинства гибридов эта активность была ниже, чем цитоли- тическая активность родительского клона ЦТЛ. Культуры, обладающие высокой специфической цитолитической активностью, клонируют в CS-среде. В каждую лунку панелей для микротитрования вносят в среднем одну гибридную клетку и 2- Ю4 облученных рентгеном 2000 Р перитоне- альных клеток в 200 мкл CS-среды. -Перитонеальные клетки получают промыванием CP брюшной полости сингенных или аллогенных мышей. По достижении конфлюентности клоны переносят в лунку Costar 3524, наращивают клетки в CS-среде и проверяют их на цитолитическую активность.

Бесплатный антивирус здесь скачать можно без регистрации.

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.