Это достигается с помощью введения в клетки наряду с изучаемым геном доминантного селектируемого маркера. Как показал Виглер, при введении гена тимидинкиназы вируса простого герпеса HSV-tk в 1-клетки и применении селективного давления среда ГАТ появляются стабильные трансформанты, которые наследуют ген HSV-tk Wigler et al.1977. Следовательно, при добавлении среды ГАТ нетрансфор- мированные клетки элиминируются, и благодаря этому можно получать чистую популяцию трансформированных клеток. Другими доминантными селектируемыми генами являются ген резистентности к неомицину пеот и ген резистентности к мико- феноловой кислоте gpt. Селективную среду ГАТ используют и в системе фибро- бластов, поскольку эффективность переноса гена в эти клетки довольно высока, а частота спонтанной реверсии для линии Ltkr очень низка 10-7. В практическом плане существенным является вопрос о доступности агента, применяемого для селекции. Среда ГАТ хороша тем, что она недорого стоит и ее легко приготовить. Многочисленные линии В- и Т-лимфоцитов, адаптированные для гибридомной техники, обладают фенотипом tkr, поэтому данную систему селекции в принципе можно применять и для этих клеточных линий. Однако частота стабильного переноса генов в лимфоидные клетки нередко очень близка к частоте спонтанной реверсии для многих из этих клеточных линий. Маллиган и Берг Mulligan, Berg, 1981 показали, что ген бактериальной ксантин — гуанин-фосфорибозилтрансферазы часто называемый геном gpt в комбинации с эукариотически- ми последовательностями, контролирующими транскрипцию, может функционировать в эукариотических клетках, придавая этим клеткам устойчивость к такому антибиотику, как мико- феноловая кислота. К тому же, поскольку этот ген является прокариотическим, клетки эукариот не могут приобретать спонтанную резистентность и этот ген можно переносить в любую клеточную линию, иными словами, не требуется наличия в трансформируемых клетках генетической мутации. Поскольку фермент gpt в пути биосинтеза находится после гипоксантин- фосфорибозилтрансферазы ГФРТ, соответствующий ген можно переносить в многочисленные линии миелом, тимом и макрофагов, обладающих фенотипом ГФРТ-; при этом будет происходить синтез GMP, компенсирующий мутацию ГФРТ. Колберт-Гарапин и др. Colbert-Garapin et al.1981, а также Саузерн и Берг Southern, Berg, 1982 показали, что при присоединении к гену бактериальной фосфотрансферазы АРН3П пеот генетических элементов, контролирующих транскрипцию, можно после введения соответствующего гена в эукариотические клетки передавать устойчивость к аминогли- козидному антибиотику G-418. Антибиотик G-418 по структуре сходен с неомицином, и ген, придающий резистентность к G-418, часто называют пеот. Поскольку пеот является прокариотическим геном он содержится в транспозонах Тп5 и ТпбО, эукариотические клетки не могут приобретать спонтанную резистентность к антибиотику.

Разумнее всего начинать строительство деревянного дома в начале лета. А вот стоимость строительства дома из бревна можно узнать в любое время года заранее.

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.