Снятые с фильтра и ресуспендированные бактерии разводят и вновь высевают для повторного скрининга. Последний проводят на нитроцеллюлозных фильтрах Millipore, номер по каталогу 13750 для получения одиночных положительных колоний с помощью гибридизационного зонда. Фильтры Millipore помещают в чашки Петри со средой L-амп Falcon, 1058, диаметр 15 см; число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. Из каждой клеточной суспензии делают разведения 102, 10_3 и Ю-4 на среде L-амп по 1 мл каждого. По 200 мкл каждого разведения наносят на з площади фильтра Grosveld et al.1981, начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Millipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий обычно около 6 ч при 37 С клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд.

Красивая парнушка без смс

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.