Для количественного определения IgE добавляют кроличьи антитела к -цепи человека, а затем конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антитела к иммуноглобулинам кролика. После окончательной отмывки определяют связанную с лунками ферментативную активность, используя раствор п-нитрофенилфосфата 1 мгмл в 10-ном ди- этаноламиновом буфере, рН 9,8. Оптическое поглощение измеряют на автоматическом фотометре Flow Multiskan. Для построения стандартных кривых используют стандартную сыворотку или известное количество очищенного иммуноглобулина. Чувствительность теста составляет 10 нгмл для IgM, IgG и IgA и 0,5 нгмл для IgE. Примесь очищенного иммуноглобулина постороннего изотипа вплоть до концентрации 10 мкгмл в тесте не обнаруживается. Т-клетки, повторно стимулированные во вторичной СКЛ и размноженные в среде GM в течение 1-2 нед, растут в суспензии, состоящей из отдельных клеток, и обладают жизнеспособностью, близкой к 100. Клетки промывают, подсчитывают и клонируют способом лимитирующих разведений в лунках с V-образным дном 96-луночных микропанелей. Каждая лунка содержит 3-Ю4 облученных МПК от того же, что и ранее, донора в 200 мкл среды GM и в среднем по 1 или 0,2 Т-клетки. Для предотвращения высыхания панели заворачивают в пластиковую пленку Saran Wrap, Dow Chemical Co. инкубируют при 37 С. Приблизительно через 2 нед клоны в лунках, содержащих размножающиеся клетки клоны по 104-105 Т-клеток, становятся хорошо заметными под микроскопом. Эффективность клонирования в различных опытах варьирует от 10 до 80. Клетки из каждой положительной лунки переносят индивиду- -ально в лунки 24-луночных панелей вместе с 5-105 облученных МПК, где они размножаются в среде GM до тех пор, пока не образуется количество клеток, достаточное для скрининга.

Рыба и снеки: российская рыба недорого. От компании FISHKA.

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.