Для предотвращения высыхания панели заворачивают в пластиковую пленку Saran Wrap, Dow Chemical Co. инкубируют при 37 С. Приблизительно через 2 нед клоны в лунках, содержащих размножающиеся клетки клоны по 104-105 Т-клеток, становятся хорошо заметными под микроскопом. Эффективность клонирования в различных опытах варьирует от 10 до 80. Клетки из каждой положительной лунки переносят индивиду- -ально в лунки 24-луночных панелей вместе с 5-105 облученных МПК, где они размножаются в среде GM до тех пор, пока не образуется количество клеток, достаточное для скрининга. Подобным образом клетки могут быть повторно клонированы при разведении 0,2 клетки на лунку. Клоны аллореактивных хелперных Т-клеток, подобно всем активным Т-клеткам, требуют для размножения in vitro в качестве ростового фактора только ИЛ-2. Способность к ответу на ИЛ-2, однако, со временем падает вследствие обратной регуляции1 down regulation рецепторов для ИЛ-2. Экспрессия рецепторов ИЛ-2 и, следовательно, способность к ответу на этот фактор роста могут быть восстановлены с помощью повторной стимуляции Т-клеток антигеном Meuer et al.1984. Короче говоря, в любой момент жизни ИЛ-2-зависимой культуры, когда проявляется тенденция к снижению скорости роста, в том числе и в тех случаях, когда размножение прекращается, клетки собирают, промывают и 2-105 Т-клеток вновь стимулируют в 2 мл среды RPMI — СПК в лунках 24-луноч С помощью этого теста измеряют способность Т-клеточных клонов пролиферировать в ответ на клетки-стимуляторы в отсутствие экзогенного ИЛ-2. Этот тест, следовательно, предназначен для определения аллоспецифичности Т-клеточных клонов. Т-клетки собирают из ИЛ-2-зависимых культур, трижды промывают и добавляют их 2-104 к облученным МПК Ю5 или к облученным клеткам ЛКЛ Ю4 в 200 мкл RPMI — СПК в лунки 96-луночных плоскодонных панелей. В контроле присутствуют 1 только Т-клетки, 2 Т-клетки плюс 10 ед.

Недавно вот нашел хороший мануал — http://seoloh.ru/obzor-softa-ot-viking-studio-viking-botovod-i-inviter/ по Viking Botovod и Viking Inviter

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.