Небольшое загрязнение хромосомной ДНК Е. coli обычно не представляет собой проблемы; однако для получения зондов, используемых в опытах по прогулке вдоль хромосомы см. ниже, мы дополнительно очищаем космидную ДНК с помощью центрифугирования в CsCl Maniatis et al.1982. Если скрининг космидной библиотеки проводили с использованием нескольких зондов, то соответствие между разными космидными клонами можно установить с помощью простого метода гибридизации дот-блот Kafatos et al.1979. К 2 мкл каждой из космидных ДНК добавляют 170 мкл 100 мМ трис-HCl, рН 7,4, 30 мкл 2 М NaOH и 100 мкл 20XSSC. Смеси прогревают при 80 С в течение 10 мин для денатурации ДНК и нейтрализуют добавлением 40 мкл 2 М трис-HCl. Каждую пробу разделяют на порции, число которых равно числу использованных для гибридизации зондов, и наносят образцы на нитро- целлюлозный фильтр с использованием фильтрационного устройства например, Minifold, Schleicher, Schiill. Фильтр разрезают таким образом, чтобы каждая полоска содержала набор точек, соответствующих всему набору космидных клонов. Далее каждую полоску гибридизуют индивидуально с одним гибридизационным зондом. В. Рестрикционное картирование Для получения рестрикционной карты космидного клона рестриктазы выбирают таким образом, чтобы нуклеотидная последовательность, которую они узнают, содержала один или два динуклеотида CpG например, Sail, Clal, Smal, Sacll, Xhol, MluI, Nrul, BssHll. Поскольку в эукариотических ДНК дину- клеотиды CpG встречаются довольно редко, в большинстве случаев эти ферменты будут узнавать лишь ограниченное число сайтов во вставке, и поэтому ими легко пользоваться для картирования.

Скрины экрана — если хочешь чтобы тебе помогли в тех. поддержке. Они там все жутко избалованные, словно начитались новостей про музыку.

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.