Экстракция нативных или фиксированных формальдегидом клеток кипящим метанолом в течение 1 мин приводит к растворению части клеточных липидов, и метанольный экстракт в ряде случаев можно использовать без дальнейшей очистки для твердофазного радиоиммунологического анализа РИА. Использование РИА описано в разд. IV. Потеря антигенной активности клетками или срезами тканей после инкубации с нейраминидазой указывает на гликопро- теиновую или гликолипидную природу антигена и свидетельствует о том, что антигенная детерминанта содержит сиаловую кислоту. Для предварительной характеристики антигенов целых клеток могут применяться и другие гликозидазы при условии, что ферменты обладают достаточной специфичностью и свободны от протеолитической активности. А. Принцип методаБольшинство методов экстракции липидов основано на процедуре Folch et al.1957, позволяющей отделить полярные мембранные липиды от неполярных липидов — холестерола и триацилглицеридов. Сначала получают суммарный экстракт с помощью смеси хлороформа и метанола 21 по объему, а затем этот экстракт фракционируют, добавляя к нему 20 воды по объему. Более тяжелую фазу, содержащую в основном неполярные липиды, можно подвергнуть повторной экстракции смесью хлороформ — метанол — вода 35047 по объему. В состав легкой фазы входят ганглиозиды, нейтральные глико- сфинголипиды с более чем тремя остатками Сахаров, фосфоли- пиды, а также следовые количества белков, солей, органических кислот и глюкозы. Ниже описан упрощенный вариант оригинального метода, который позволяет получать препараты липидов, дающие удовлетворительные результаты при твердофазном РИА. Более полный выход ганглиозидов достигается при экстракции смесью хлороформ — метанол Svennerholm, Fredman, 1980 или смесью диизопропиловый эфир-1-бутанол Ladisch, Gillard, 1983. Для экстракции сильнополярных фосфатидили- нозитолфосфатов необходимы очень низкие значения рН Schacht, 1981, при которых разрушаются ганглиозиды. Легкую фазу липидного экстракта, полученного по методу Фолша, можно использовать в качестве антигена при твердофазном РИА без очистки или с дальнейшей очисткой. Его очистка состоит в освобождении от солей и низкомолекулярных примесей диализом или, что быстрее, адсорбцией липидов на патроне для обратнофазовой хроматографии с последующей элюцией их органическим растворителем. Освобождение экстракта от солей и низкомолекулярных примесей является обязательным этапом, если материал будет использован для ТСХ.

блог о политике

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.