Если в методе Окаямы — Берга в качестве линкера использовать фрагмент 7mdIII — Pvul плазмиды ptrpLM, то все молекулы кДНК библиотеки будут обладать промотором, участком связывания рибосомы и кодоном AUG, и большинство клонов, включая неполные кДНК, будут экспрессироваться при индукции триптофанового оперона. Поскольку плазмида содержит триптофановый промотор, репрессированный в нормальных условиях, необходимо индуцировать клетки, чтобы получить экспрессию тех кДЦК которые могут содержаться в плазмидах. Обычно в качестве мощного индуктора триптофанового оперона применяют индолилакрило- вую кислоту ИАК Morse et al.1969. Индуцируемые клетки выращивают на среде М9, содержащей 0,25 казаминокис- лот и 0,5 глюкозы. После выращивания в течение ночи при температуре 30 С культуру разбавляют в 10 раз свежей средой М9 плюс казаминокислоты и глюкоза инкубируют при 30 С 1 ч. Добавляют 1100 объема раствора ИАК 1,5 мгмл в этаноле инкубируют культуру еще 2 ч при 30 С Halle- well, Emetage, 1980. Для экспрессии кДНК в эукариотических клетках необходимо вставить в вектор эукариотический промотор, эукариоти- ческий сайт связывания с рибосомой, сигнал для сплайсинга РНК если это необходимо, сигнал терминации транскрипции или сигнал для присоединения poly А-концевой последовательности. Было опубликовано много успешных работ по экспрессии клонированной геномной ДНК в эукариотических клетках, поскольку клоны геномной ДНК обладают всем необходимым для экспрессии. В то же время экспрессия кДНК в эукариотических клетках — задача не из легких. Общий подход ее решения был разработан Окаямой и Бергом Okayama, Berg, 1983. Однако предложенные ими плазмидные векторы не содержат маркеров для селекции, которые необходимы для того, чтобы на ранних стадиях идентифицировать трансформированные клетки. Недавно Окаяма и Берг разработали новый метод трансформации эукариотических клеток с помощью вектора, представляющего собой комплекс кДНКплазмидафаг с геном NEO, с помощью которого можно получить высокую эффективность трансформации, до 1-3 П. Берг, личное сообщение.

торрент

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.