твердофазный метод крысиныхФлакон закрывают крышкой, его содержимое перемешивают на вортексе, быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -70 С. Для отбора бактерий соскабливают некоторое количество клеток из замороженной суспензии, не подвергая оттаиванию основной материал, и выращивают. Во избежание непредвиденных случайностей клонированную ДНК сохраняют. В случае, если клетки теряются или утрачивают жизнеспособность, ДНК можно разрезать по уникальному рестрикционному сайту в векторе или во вставке, лигировать ее саму на себя и вновь подвергнуть упаковке in vitro. Такую клонированную космидную ДНК можно вводить в клетки-хозяева Е. coli 490А. Приведенная ниже пропись представляет собой несколько модифицированную методику, описанную Бирнбоймом Birn- boim, 1983. 400 мл бульона L-амп в двухлитровой колбе засевают свежей одиночной колонией или же бактериями, соскобленными из замороженного хранящегося материала. Колбу закрывают стерильной алюминиевой фольгой не ватной пробкой инкубируют на качалке в течение ночи при 37 С и при 300 обмин. Клеточную суспензию центрифугируют в полипропиленовых центрифужных стаканах объемом 400 мл ротор GS3 Sorvall 6000 обмин, 10 мин, 4С. Осадки ресуспендируют в ледяном ТНЭ-буфере 40 мл, суспензию переносят в пробирки на 50 мл Falcon, 2070 и центрифугируют Minifuge, Не- raeus, 6000 обмин, 10 мин, 4С. Осадки ресуспендируют в 5 мл раствора для щелочного лизиса А, ставят в лед и добавляют 10 мл раствора для щелочного лизиса Б. Аккуратно перемешивают содержимое пробирок переворачиванием и оставляют их во льду на 15 мин. Добавляют 7,5 мл 5 М ацетата калия, рН 6, аккуратно перемешивают и оставляют во льду еще на 15 мин. Лизированные клетки переносят в поликарбонатные стаканы с алюминиевыми крышками Beckman и осаждают хромосомную ДНК центрифугированием в роторе Ti 60 Beckman при 30 000 обмин в течение 30 мин при 4С. Надо- садочную жидкость переносят в чистые пробирки на 50 мл Falcon, добавляют 10 мл фенола, перемешивают на вортексе и добавляют 10 мл севага. Вновь перемешивают на вортексе и разделяют фазы с помощью центрифугирования 6000 обмин, 10 мин, комнатная температура.

Вместе мы создадим авторский дизайн интерьера, а материалы для строительства и отделки подберем на Ваш вкус и кошелек.

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.