Общий объем клеток селезенки и миеломных клеток не должен превышать 10 мл. Лучше всего использовать объемы от 5 до 10 мл, так как при больших объемах имеет место эффект расслоения клеток по плотности, приводящий к отделению более крупных миеломных клеток от спленоцитов. Образец объемом 5-10 мл центрифугируют в конической пробирке на 50 мл при 250 g 5 мин и удаляют супернатант. К клеткам добавляют по каплям 1 мл 50-ного ПЭГ 4000, рН 7,2-7,4, подогретого до 37 С. В ходе добавления ПЭГ клеточную суспензию постоянно перемешивают. После 60 с инкубации с ПЭГ медленно добавляют 20 мл СРглюкозы, подогретой до 37 С. Смесь инкубируют 2 мин, а затем добавляют 30 мл CPглюкозы и центрифугируют при 250 g 5 мин. После центрифугирования супернатант удаляют, а клеточный осадок осторожно ресуспендируют в 5-10 мл полной куль- туральной среды, содержащей сыворотку плода коровы СПК. Мы обычно используем минимальную среду Игла МСИ, модифицированную Дульбекко МСИД; McKearn et al.1984, с добавлением сыворотки, однако применение среды RPMI-1640 также дает хорошие результаты. Далее мы будем называть полную среду для гибридов средой МСИД. После слияния определяют число жизнеспособных клеток, которое является показателем эффективности методики обычно выход 70-80 живых клеток. Клетки ресуспендируют до плотности 2-Ю6 жизнеспособных клеток в 1 мл и всю суспензию вносят в плоскодонные лунки 96-луночных панелей по 100 мкл на лунку. Инкубируют культуру при 37С в СОг-инкубаторе при влажности 90.

Приспичило купить chevrolet epica? Отлично! Вам дорога в наш автосалон!

Оставить комментарий

Вы должны авторизоваться для отправки комментария.