Архив рубрики «Методы»

Если объем ДНК превышает 2 мл, то ее осаждают этанолом Maniatis et al.1982 и вновь растворяют в ТЭ-буфере 2 мл в течение ночи. После центрифугирования из пробирок с помощью насоса медленно отбирают фракции по 0,7 мл собирают около 30 фракций с помощью коллектора. По 10 мкл каждой из фракций 1-17 анализируют в 0,3-ном агарозном геле вместе с маркерными фрагментами ДНК фага К, которые наносят на среднюю и крайние дорожки геля. К маркерным фрагментам добавляют по 10 мкл 40-ного раствора сахарозы, чтобы концентрация сахарозы и солей в них была такой же, как и в пробах. Длительность электрофореза составляет 16 ч при 40 В. Фракции, содержащие фрагменты ДНК размером от 30 до 50 kb, объединяют фракции, содержащие фрагменты ДНК размером 30 kb отбрасывают и осаждают 2,5 объемами этанола соль дополнительно не добавляют. Материал перемешивают и оставляют при -25 С на ночь. На следующий день пробирки нагревают до комнатной температуры для того чтобы растворить сахарозу, если она выпала в осадок и собирают ДНК центрифугированием. Если общий объем составляет 10 мл, то ДНК осаждают в полиалломерной пробирке ротора SW27. Чтобы пробирка не разрушилась при центрифугировании, ее заполняют доверху 70-ным этанолом. Длительность центрифу- Представленная ниже пропись относится к космидному вектору pNNL Brosveld et al.1982, содержащему ген Eco-gpt, облегчающий перенос клонированных генов в эукариотические клетки. Эту пропись с соответствующими модификациями можно применить и в случае других космидных векторов. Одну аликвоту ДНК вектора pNNL 20 мкг гидролизуют рестрикта- зой Нра, а другую такую же — рестриктазой Clal. Добавляют по 20 ед. каждого фермента инкубируют 4 ч при 37 С.

В любое время Вы можете при желании пойти в институт бизнеса и политики, чтобы получить второе высшее образование, которое на сегодня считается престижным.

тот и к клеткам добавляют по каплям 1982Тонкослойная хроматография ТСХ на покрытых слоем си- ликагеля пластинах является весьма эффективным методом анализа сложных смесей липидов. Проходящий через носитель элю- ент переносит отдельные липиды с разной скоростью в зависимости от их полярности, в результате чего липидные компоненты оказываются на разных расстояниях от места нанесения. Неполярные нейтральные липиды перемещаются почти с фронтом растворителя, в то время как полярные липиды задерживаются в соответствии с увеличением заряда и степени полярности. Соответствующие липидам фракции можно увидеть после обработки пластины парами йода или опрыскивания специальными окрашивающими реагентами. Для изучения гликолипидных антигенов чрезвычайно полезным оказался впервые описанный Маньяни и соавторами Mag- nani et al.1980 элегантный метод, представляющий собой комбинацию ТСХ и РИА. При использовании этого метода хро- матограмму сначала инкубируют с моноклональными антителами, а затем с меченными 1251 антителами против IgG мыши. Обладающие антигенной активностью липиды выявляют с помощью радиоавтографии отмытой и высушенной хроматограм- мы рис. 9-3. В сходном методе Towb, in et al.1984 липиды переносят блоттингом с хроматограммы на нитроцеллюлозный фильтр, который затем обрабатывают антителами таким же образом. С помощью этого метода можно выявлять антигены в количестве до нескольких нанограммов, т. е. его чувствительность на два порядка выше чувствительности, достигаемой при химическом детектировании с использованием паров иода и красящих реагентов. Не все виды покрытых силикагелем пластин для ТСХ одинаково пригодны для иммунологического выявления липидов.

денежный мешок

здесь метод d alt-кассетыПосле того как фильтр для получения реплики пришел в контакт с исходным фильтром, их нельзя сдвигать относительно друг друга. Полученный сэндвич накрывают стерильной бумагой Whatman 3 ММ и сдавливают большой пластмассовой коробкой с плоским дном. Верхнюю бумагу Whatman 3 ММ выбрасывают иглой для шприца 20 GIV2, содержащей тушь, маркируют фильтры, делая в них 10 отверстий 3 внизу, 3 в середине, 3 вверху и одно в левом верхнем углу. Фильтры осторожно отделяют друг от друга и опять помещают в чашки с агаром L-амп колониями вверх. Фильтр, использованный для получения реплики, кладут в свою чашку, в то время как исходный фильтр помещают в чашку со свежим агаром L-амп. Исходный фильтр инкубируют 1-2 ч при 37 С, после чего аналогичным образом получают вторую реплику. Маркирование отверстия исходного фильтра переносят на вторую реплику с помощью иглы. После получения второй реплики исходный фильтр помещают в чашку со средой HMF-1 амп. С каждого исходного фильтра необходимо получить по три реплики. Третий набор фильтров с репликами инкубируют в чашках со средой HMF-1 амп. Наконец, четвертый фильтр с репликой используют фильтры, смоченные в чашках со средой HMF-1 амп готовят для каждого из исходных фильтров. Два последние фильтра, однако, не отделяют друг от друга, а замораживают в виде сэндвича Hanahan, Meselson, 1983. Сэндвич, обернутый листами бумаги Whatman 3 ММ, смоченными водой, кладут в полиэтиленовый мешочек, который заплавляют и замораживают при -70 С. Три фильтра-реплики, полученные от каждого исходного фильтра два набора на агаре L-амп, один на агаре HMF-1 амп, подращивают при 37С до тех пор, пока диаметр колоний не станет равным 1 мм. Первые два набора используют для скрининга библиотеки с помощью гибридизации см. ниже, в то время как третий набор, инкубированный в чашках с агаром HMF-1 амп, переносят в чашки с агаром HMF-2 амп и оставляют на 2 ч при комнатной температуре.

Все знают курорт Белокуриху как уникальный по свойствам курорт Сибири.

Чем меньше размер частиц, тем меньше значение Н и тем выше разрешение. Однако, чтобы сохранить скорость потока подвижной фазы при уменьшении размера частиц, требуется повышение давления, причем с увеличением скорости потока подвижной фазы такое повышение должно возрастать. Использование пористых частиц позволяет снизить давление подачи элюента, но при этом одновременно снизится эффективность колонки. В общем между степенью пористости носителя и эффективностью фракционирования можно найти оптимальное соотношение, при котором достигается эффективное и быстрое разделение. Более подробно эти факторы обсуждают Снай- дер и Керклэнд Snyder, Kirkland, 1979. Как было отмечено выше, для ВЖХ белков разработаны новые типы матриц, которые позволили устранить многие негативные факторы при хроматографии. Первой существенной модификацией, которая привела к значительным положительным эффектам, было улучшение покрытия матриц требуемым адсорбирующим компонентом, например алкильными группами в случае ОФ-ВЖХ, а также блокировка остальных свободных си- ланольных групп низкомолекулярными модифицирующими алкильными группами. Эту модификацию называют еще блокировкой концов. Большинство матриц для ВЖХ делают на основе силикагеля или органических полимеров. В случае сили- кагельных носителей большие трудности возникали из-за веществ, которые практически необратимо связывались со свободными силанольными группами, не заблокированными после пришивки алкильных групп. Вероятность такого связывания особенно велика для белков. Их десорбция при последующих разделениях может приводить к загрязнению препаратов. Благодаря усовершенствованию методов модификации матриц и модификации свободных силанольных групп негативное влияние неспецифической адсорбции на матрицах для ВЖХ было значительно уменьшено. В настоящее время разнообразие оборудования для ВЖХ белков столь огромно, что описать его детально невозможно.

секс

Зависимость от алкоголя или наркотических средств очень сильная. Человеку трудно самостоятельно бороться с этой проблемой. Есть очень мало людей, которые обладают огромной силой воли, помогающим избавиться от зависимости без вмешательства специалистов.
Прочитать остальную часть записи »

Сейчас очевидно, что анализ ответов В-клеток на действие различных факторов не является такой же стандартной процедурой, как в случае аналогичных реакций Т-клеток. Несмотря на сообщения о возможности длительного культивирования нетрансформированных В-клеточных линий Howard et al.1981, по-прежнему отсутствуют надежные и воспроизводимые методы получения и поддержания таких линий. Целью этой главы является не обсуждение моделей активации В-клеток, а описание методик определения активности факторов, стимулирующих пролиферацию В-клеток. Для того чтобы методика тестирования была приемлемой, она должна отвечать ряду требований. В системе должно достигаться насыщение, т. е. кривая титрования активности должна иметь выход на плато. При разбавлении фактора эта кривая должна соответствовать одноударной кинетике, и, наконец, в предельных разведениях должен достигаться фоновый уровень. Применение культуральных сред на основе RPMI 1640 или модифицированной Дульбекко минимальной среды с коррекцией по Искову дает примерно одинаковые результаты. К этим средам добавляют антибиотики, р-меркаптоэтанол 5- Ю-5 М и соответствующее количество сыворотки плода коровы СПК см. ниже. К среде RPMI добавляют также L-глу- тамин и пируват до конечной концентрации 1. б.

Поверьте, наша услуга доступна всем студентам и ученикам. Четкое и недорогое выполнение контрольных на заказ. Удобство оформления каждого заказа.

Липосомы содержат не более 507о мембранных белков по массе. Это примерно соответствует составу мембран лимфоцитов. Для получения липосом смешивают липиды и мембранные белки в растворе детергента, а затем детергент удаляют. Поскольку удаление тритона Х-100 диализом — процесс весьма длительный, более предпочтительно его удаление с помощью сорбции на полистирольных гранулах SM2. Они представляют собой гидрофобные частицы, способные к сильной адсорбции молекул детергента Holloway, 1973. Смесь липидов и белков в растворе детергента инкубируют, встряхивая ее с гранулами SM2 до тех пор, пока не сформируются липосомы. К смеси, содержащей 1 мг липидов, 1 мг белков и 10 мг тритона Х-100 в объеме 1 мл, добавляют 0,25 мл буфера для реассоциации и 0,2 мл гранул SM2. Инкубируют смесь при постоянном встряхивании 3 ч при 20 С, а затем удаляют жидкую фазу и добавляют к ней новую порцию 0,2 мл гранул SM2. После еще одной инкубации со встряхиванием в течение 3 ч супернатант должен начать опалесцировать, что указывает на образование липосом. Если белки, выделенные на лентил-лектиновом или иммунном носителе, требуется реассоциировать с липидами после удаления детергента диализом, то необходимо заменить тритон Х-100 на детергент с малым размером мицелл, например на ок- тилглюкозид. Это легче всего сделать в тот момент, когда белки адсорбированы на аффинной колонке. Через колонку пропускают один объем буфера без тритона Х-100, содержащего 4,5 мгмл октилглюкозида. К липидно-детергентной пленке добавляют раствор белка и тщательно перемешивают смесь при комнатной температуре. Смесь переносят в диализный мешочек и диализуют против буфера для реассоциации в течение 18 ч с тремя сменами буфера. На образование липосом указывает появление в липидно-белко- вой смеси опалесценции. Е.

фотошоп скачать бесплатно

Небольшое загрязнение хромосомной ДНК Е. coli обычно не представляет собой проблемы; однако для получения зондов, используемых в опытах по прогулке вдоль хромосомы см. ниже, мы дополнительно очищаем космидную ДНК с помощью центрифугирования в CsCl Maniatis et al.1982. Если скрининг космидной библиотеки проводили с использованием нескольких зондов, то соответствие между разными космидными клонами можно установить с помощью простого метода гибридизации дот-блот Kafatos et al.1979. К 2 мкл каждой из космидных ДНК добавляют 170 мкл 100 мМ трис-HCl, рН 7,4, 30 мкл 2 М NaOH и 100 мкл 20XSSC. Смеси прогревают при 80 С в течение 10 мин для денатурации ДНК и нейтрализуют добавлением 40 мкл 2 М трис-HCl. Каждую пробу разделяют на порции, число которых равно числу использованных для гибридизации зондов, и наносят образцы на нитро- целлюлозный фильтр с использованием фильтрационного устройства например, Minifold, Schleicher, Schiill. Фильтр разрезают таким образом, чтобы каждая полоска содержала набор точек, соответствующих всему набору космидных клонов. Далее каждую полоску гибридизуют индивидуально с одним гибридизационным зондом. В. Рестрикционное картирование Для получения рестрикционной карты космидного клона рестриктазы выбирают таким образом, чтобы нуклеотидная последовательность, которую они узнают, содержала один или два динуклеотида CpG например, Sail, Clal, Smal, Sacll, Xhol, MluI, Nrul, BssHll. Поскольку в эукариотических ДНК дину- клеотиды CpG встречаются довольно редко, в большинстве случаев эти ферменты будут узнавать лишь ограниченное число сайтов во вставке, и поэтому ими легко пользоваться для картирования.

Скрины экрана — если хочешь чтобы тебе помогли в тех. поддержке. Они там все жутко избалованные, словно начитались новостей про музыку.

Фильтры Millipore помещают в чашки Петри со средой L-амп Falcon, 1058, диаметр 15 см; число чашек должно соответствовать числу положительных колоний в исходном скрининге. Из каждой клеточной суспензии делают разведения 102, 10_3 и Ю-4 на среде L-амп по 1 мл каждого. По 200 мкл каждого разведения наносят на з площади фильтра Grosveld et al.1981, начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Millipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий обычно около 6 ч при 37 С клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 С используют для последующего отбора положительных колоний. Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее разд. IV, А. Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга разд. IV, Б, который прогревают 10- 15 мин при 70 С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию разд.

Строительные бригады

Поскольку большинство белков, упоминаемых в литературе, имеют значения pl8 Righetti et al.1981, анионообменники применяют более широко, чем катионообменники Gupta et al.1983. Как и в других случаях, при разделении крупных белков критическим фактором является размер пор ионообменника. Показано, что анионообменники с размером пор до 4000 А применимы для хроматографии белков, имеющих мол. массу 200 000-400 000 Regnier, 1983. Раньше отдавали предпочтение слабым ионообменникам, но теперь показано, что сильный анионообменник Mono Q зарегистрированная торговая марка фирмы Pharmacia и сильный катионообменник Mono S зарегистрированная торговая марка фирмы Pharmacia обладают рядом преимуществ. Они характеризуются более высокой разрешающей способностью, более легко прогнозируемым временем задержки веществ и лучшим выходом белков, чем использовавшиеся ранее матрицы на основе силикагеля Kopaciewicz, Regnier, 1983. Эти новые анионообменники созданы на основе гидрофильной полиэфирной смолы Richey, 1982 имеют дополнительное преимущество они устойчивы в широком диапазоне рН 2-12. Силика- гельные матрицы используются только при рН 8, при больших значениях рН силикагель растворим. Хотя при обратнофазовой в обращенных фазах ВЖХ белков необходимо использование денатурирующих растворов с низким рН и органических растворителей в высоких концентрациях, она приобрела в последние годы большую популярность. Основные достижения в этой области рассмотрены в специальных обзорах Alvarez et al.1981; Regnier, 1983. При работе с некоторыми недавно созданными матрицами для ВЖХ на основе силикагеля могут использоваться мягкие условия элюции, приближающиеся к тем, которые применяются для разделений по гидрофобным свойствам на обычных носителях Kato et al.1983; Fausnaugh et al.1984; Gooding et al.

Партнерские программы для заработка