Архив рубрики «Методы»

Обогащение мембранными гликопротеина- ми достигается за счет применения иммобилизованных лекти- нов, таких как гемагглютинин из чечевицы Lens culinaris ГЧ. для содержащих маннозу гликопротеинов и лектин из касторовых бобов Ricinus communis RcH, или ЛБ, специфичный. галактозе. Выделение индивидуального поверхностного белка с помощью иммуносорбента с моноклональными антителами мы. проиллюстрируем здесь на примере получения молекул Н-2КЬ. Реагенты. Забуференный трисом солевой раствор TCP 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 130 мМ NaCl. Лизирующий буферный раствор 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, содержащий 3 мМ MgCl2, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид ФМСФ Sigma и 100 ед. мл апротинина Sigma. Около 109 лимфоидных клеток из 15 селезенок промывают. в изотоническом TCP и осаждают в 50-миллшштровой пластмассовой центрифужной пробирке. Для контроля промежуточных этапов выделения целесообразно пометить небольшое число клеток 355-метионином инкубация в течение ночи и добавить меченые клетки к основному клеточному пулу. Затем с помощью пастеровской пипетки клетки ресуспендируют в 1 мл охлажденного до нулевой температуры лизирующего буфера, добавляют еще 9 мл этого охлажденного буфера и клеточную суспензию инкубируют в ледяной бане в течение 30 мин. Затем клеточную суспензию гомогенизируют при нулевой температуре 10-20 движениями пестика в гомогенизаторе Даунса стекло — стекло. На этом этапе при рассматривании препарата в микроскоп интактными должны оставаться только ядра клеток. Если присутствует более 10 интактных клеток, то следует дополнительно гомогенизировать клеточную суспензию 10 движениями пестика. Гомогенат снова помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют в центрифуге с охлаждением при 2000 обмин для удаления ядер. Мутный супернатант собирают и добавляют к нему сухую сахарозу до конечной концентрации 40 вес объем.

Прекрасный вариант swatch часы full blooded.

чашки добавляют ионообменные носители для вжх антитела дляТаким образом, улучшенные матрицы, наличие разнообразных колонок и увеличение их емкостей дают возможность исследователям в области иммунохимии использовать присущие ВЖХ высокую чувствительность, хорошее разрешение и быструю элюцию. В этой главе будут детально обсуждены три типа хроматографических разделений, используемых в нашей лаборатории для очистки иммуноглобулинов изучения их структуры. Речь пойдет о методах ГП-ВЖХ, ОФ-ВЖХ и ГА-ВЖХ. Разделение молекул при жидкостной хроматографии достигается за счет их распределения между подвижной фазой растворителем и стационарной фазой матрицей колонки. Если молекулы вещества X в большей степени связываются с матрицей, чем молекулы вещества Y, то вещество Y будет элюиро- ваться с колонки раньше, чем вещество X. В случае гель-прони- кающей хроматографии ГПХ стационарная фаза представляет собой пористые гранулы. Здесь разделение молекул достигается за счет того, что поры дифференциально замедляют движение веществ в колонке. Некоторые низкомолекулярные вещества полностью входят в поры гранул носителя, другие, более крупные, входят только частично или совсем не входят. Молекула Б, более крупная, чем молекула А, будет элюироваться с колонки раньше, чем молекула А. Все молекулы, которые не входят в поры гранул носителя, сойдут с колонки в той порции элюата, которая называется исключенным или свободным объемом Vo. Все другие молекулы будут элюироваться с колонки в зависимости от их размера. Самые маленькие молекулы, способные входить в поры носителя без какого-либо взаимодействия с ним, элюируются объемом растворителя, который называют полным объемом Vt. Другие варианты жидкостной хроматографии также основаны на различиях в равновесных распределениях разделяемых молекул между стационарной и подвижной фазами. В случаеобратнофазовой жидкостной хроматографии ОФХ стационарной фазой является твердый носитель с пришитой органической неполярной группой. Вещества связываются с носителем благодаря сродству к этим неполярным группам. Таким образом, здесь степень связывания фракционируемых веществ с носителем обусловлена их гидрофобными свойствами. Обычно пришивают линейные алкильные углеводородные цепи, хотя иногда используются и фенильные, и дифенильные группы.

Обеспечат надёжную защиту любого жилища разнообразные клинские металлические двери с кодовым замком и фотоэлементом имеющие большой срок эксплуатации.

Потягиваться приятно потому, что в период сна тело находится лишь в нескольких положениях и после пробуждения мышцы требуют разминки. В данном случае потягивание – это своеобразная зарядка для нашего тела. Она необходима нам, поскольку мышцы долгое время отдыхали, расслаблялись и были в неподвижном состоянии. Таким образом мышцы подготавливаются к повседневной работе, восстанавливает нормальное кровообращение и переводит организм из режима сна в режим активности.
Прочитать остальную часть записи »

колберт-гарапин и др. методабольшинство методовПосле того как место нанесения высохнет, пластину помещают в стеклянный сосуд для ТСХ, в котором содержится 100 мл проявляющего раствора, заранее уравновешенного с газообразной фазой. Пластину вынимают до того, как растворитель достигнет ее верхнего края. Полностью сухую пластину погружают на 30 с в полиизобутилметакрилат, растворенный в гексане. Как уже отмечалось выше, эта обработка не является обязательной. Сухую пластину выдерживают в течение 30 мин при 4С в буфере Б. Пузырьки воздуха, прикрепившиеся к пластине, следует удалить концом пипетки. Пластину вынимают из буфера Б и тыльную сторону тщательно протирают. Затем ее кладут на кусок парафильма, чуть больший по площади, чем сама пластина, и помещают во влажную камеру. Надосадочную жидкость гибридом разводят в соотношении 1 1 буфером Б и осторожно наслаивают по каплям на хроматограмму 100 мкл на» 1 см2. Влажную камеру устанавливают строго горизонтально. После инкубации в течение 6 ч при 4С пластину промывают 6 раз по 1 мин охлажденным ЗФР на качалке для удаления избытка антител. Затем инкубацию повторяют в тех же условиях с меченными 1251-антителами 5-Ю6 импмин-мл против IgG мыши в буфере Б. После инкубации в течение 6-12 ч и отмывки ЗФР в тех же условиях хроматограмму высушивают и экспонируют с рентгеновской пленкой. Д. Химическое окрашивание Пластину для ВЭТСХ с алюминиевой или, что предпочтительнее, стеклянной подложкой размечают карандашом; образцы минимальное количество 1 мкг наносят на пластину, как описано выше. После хроматографии и высушивания пластину подвергают действию паров иода в течение 5 мин. При этой обработке все нейтральные липиды, фосфолипиды и гликолипиды окрашиваются в цвета от желтого до темно-коричневого.

Тренажерный зал

Другой подход заключается в использовании векторов на основе ретровирусов, которые дают высокую эффективность трансформации интеграции ДНК в хромосомы. В этом случае необходимо решить проблему, как можно после идентификации клона повторно вырезать интегрированную кДНК из ДНК клетки и амплифицировать. Успехи, достигнутые на протяжении последних лет в области генетической инженерии и методов переноса генов, дали возможность непосредственно решать многочисленные вопросы, касающиеся экспрессии генов и регуляции их активности. Гены высокоспециализированных клеток, таких как клетки В-лимфо- цитарного направления дифференцировки, были перенесены в нелимфоидные клеточные линии для изучения тканеспецифиче- ских контрольных элементов на уровне ДНК Banerji et al.1983; Gillies et al.1983. Путем микроинъекции генов, кодирующих немодифициро- ванные легкие цепи иммуноглобулинов Briuster et al.1983, или путем введения искусственных конструкций, содержащих полные функциональные гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов Rusconi, Kohler, 1985, были получены трансгенные мыши. Исследования на таких мышах дали ценную информацию в отношении перестройки иммуноглобу- линовых генов, механизмов активации и эффектов обратной связи во время дифференцировки В-клеток в присутствии функционально перестроенного полного гена иммуноглобулина. Гены, модифицированные in vitro и вносимые в определенные клеточные линии, дают возможность нового подхода к изучению определенного клеточного продукта на разных стадиях, начиная от перестройки или активации транскрипции и кончая последними этапами, а также многочисленными стадиями про- цессинга между ними. На протяжении последних нескольких лет методы генетической инженерии значительно упростились и в настоящее время широкодоступны. В данной главе мы остановимся на нескольких основных процедурах. После ознакомления с ними будет нетрудно использовать описанные здесь методы для изучения новых систем. Векторы, используемые для клеточной трансформации, представляют собой плазмиды, которые помимо участка начала репликации содержат один ген резистентности, применяющийся для селекции в клетках прокариот, и второй ген резистентности, который может использоваться для селекции в эукариотических клетках. Такие векторы имеют также несколько сайтов рестрикции, по которым и проводят клонирование нужного гена. Ряд векторов, обладающих этими свойствами, показан на рис.

Ищете специалистов по строительству бани хамам ? Компания «А-Строй» выполнит работы качественно и в срок! Выполняем проектирование, строительство и комплектацию хаммамов.+7 495-601-73-01.

содержат панель для микротитрованияПернисом, Immunological Methods1 Fathman, 1979; Forni, 1979; Johnson, 1979; Stocker, Bernoco, 1979; здесь мы коснемся лишь наиболее распространенных из. Чаще других используют метод, основанный на комплемент- зависимом лизисе клеток. Этот метод прост и не требует дорогостоящих реактивов, а его микровариант можно проводить с очень малым числом клеток. Основным недостатком метода является то, что его можно использовать только с комплемент- связывающими антителами, а также то, что необходимо присутствие магического ингредиента, каким является хороший жомплемент, и живых клеток-мишеней, свободных от побочных Имеется русский перевод Методы исследований в иммунологии, М Мир, 1981. аутоантител. К недостаткам относится также необходимость оценки результатов с помощью микроскопа, если не применяется метод освобождения 51Сг. Флуорохромы можно присоединять непосредственно к моно- клональным антителам, или, как это делается чаще всего, можно пометить вторичный реагент для непрямого выявления антител, такой, например, как белок А из Staphylococcus aureus или антитела против иммуноглобулинов. Флуоресцентное окрашивание дает существенную информацию о распределении антигена в смешанных клеточных популяциях, однако наблюдения в микроскоп занимают много времени их интерпретация не всегда объективна. К тому же флуоресцентный клеточный сор- тер не всегда доступен, и работа на нем обычно требует предварительных заявок и планирования. Для того чтобы получить радиоактивно меченные антитела, обычно используют 1251. Следует иметь в виду, что некоторые моноклональные антитела при иодировании теряют связывающую активность если у них в связывающем центре содержится тирозин. Вместе с тем высокая удельная активность и удобство использования гамма-счетчиков при применении 1251 заставляют примириться с коротким периодом полураспада изотопа. Если анализируется большое число разных антител, то выгодней метить вторичный реагент для их непрямого выявления. Правда, белок А можно использовать только для некоторых классов антител, антитела против иммуноглобулинов не всегда могут применяться при работе с В-клетками. Если гибридомная линия, синтезирующая необходимые моноклональные антитела, отсутствует, то приходится использовать один из перечисленных выше методов мечения антител. Однако и в этом случае можно в дальнейшем предусмотреть биосинтетическое введение метки в антииммуноглобулиновые моноклональные антитела, поскольку их можно использовать вместо иодированных реагентов. В принципе можно использовать любую меченную радиоактивным изотопом аминокислоту, которая включается в белки с достаточной эффективностью. Мы, например, предпочитаем 3Н-лейцин.

http://www.tyt-skazki.ru — отсюда я читаю сказки для своих детей

1976, который на дно 12 кеадратных пластмассовых чашек среду разливаютНа первом этапе получают клетки тимуса крысы и вносят их в лунки панелей для микротитрования Costar. Для этого самок крыс Lewis не старше 5 нед забивают методом асфиксии в СОг- Стерильно удаляют у них тимус, отделяя последний от околотимусных лимфатических узлов, разрезают его на мелкие кусочки острыми ножницами и затем осторожно продавливают через стерильное ситечко, используя поршень шприца на 5 мл. Полученную клеточную суспензию дважды промывают CP 200 g, 10 мин, 4С и ресуспендируют приблизительно в 20 мл МСИДИ без сыворотки. Если слой клеток тимуса используют в тот же день, то МСИДИ должна содержать 50 мкг ЛПС на 1 мл. Вместе с тем можно приготовить этот слой за 3 дня до использования. В этом случае клетки инкубируют при 37 С и 5 С02 в МСИДИ без ЛПС. Готовят суспензию, содержащую 6-10 клеток тимуса в 1 мл, и мультиканальной пипеткой Titertek 77-890-07; Flow Laboratories Irvine, Scotland разливают по 100 мкл этой суспензии в каждую лунку панели для микротитрования. Таким образом, каждая лунка содержит 6-Ю5 клеток. Периферические лунки не используют, так как из них быстро испаряется среда. Частоту встречаемости функционально активных В-клеток в пробах, отобранных из созревающих культур, определяют методом лимитирующих разведений Lefkovits, Waldmann, 1979. Количество клеток, вносимых в микрокультуры, должно перекрывать ожидаемое число зрелых В-клеток день 0 103- 104; дни 1, 2 и 5-7 10-3-Ю2; дни 3, 4 и 10-14 30-3-Ю3. Для тестирования каждой концентрации клеток заполняют 60 одинаковых лунок.

Цифровая камера Ricoh GR Digital IV

Ниже фильтры хранят при -70 С в картонной коробке, а для дальнейшей работы используют проявленную пленку разд. IV, Б. Для того чтобы идентифицировать положительные сигналы, после того как фильтр совмещен с бумагой 3 ММ в соответствии с метками, нанесенными радиоактивными чернилами используют просвечивающий осветитель, маркирующие точки с фильтра переносят на пленку. Положительные гибридизацион- ные сигналы должны присутствовать на обеих репликах, полученных с одного и того же исходного фильтра, что позволяет легко отличить их от ложных радиоактивных сигналов, обусловленных фоновой гибридизацией. Положительные сигналы обозначают соответствующим номером клона. Для отсева положительных колоний из морозильника достают чашки со средой HMF-2 амп, содержащие фильтры с замороженными бактериями. Им дают возможность оттаять при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего фильтры вынимают и вносят в чашки со свежей средой L-амп. Если фильтры слишком влажные, их подсушивают в течение короткого времени на бумаге Whatman 3 ММ. Бактериям дают возможность восстановить свою жизнеспособность с помощью инкубации их в чашках при комнатной температуре в течение 2 ч. Пленку для радиоавтографии помещают на световой ящик и закрывают ее пленкой Saran, на которую кладут фильтр, содержащий живые колонии. Фильтр и пленку совмещают с помощью маркирующих отверстий. Область над положительным сигналом соскабливают стерильной зубочисткой и суспендируют бактерии в 500 мкл бульона L-амп. Фильтр кладут в чашку со средой HMF-2 амп и оставляют ее при комнатной температуре еще на 2 ч.

Экстремальное Порно

IV, Б, 2 с клетками BW5147, обладают специфической цитолитической активностью, однако у большинства гибридов эта активность была ниже, чем цитоли- тическая активность родительского клона ЦТЛ. Культуры, обладающие высокой специфической цитолитической активностью, клонируют в CS-среде. В каждую лунку панелей для микротитрования вносят в среднем одну гибридную клетку и 2- Ю4 облученных рентгеном 2000 Р перитоне- альных клеток в 200 мкл CS-среды. -Перитонеальные клетки получают промыванием CP брюшной полости сингенных или аллогенных мышей. По достижении конфлюентности клоны переносят в лунку Costar 3524, наращивают клетки в CS-среде и проверяют их на цитолитическую активность. Клоны, обладающие высокой цитолитической активностью, культивируют в CS-среде и обычно повторно клонируют несколько раз, для того чтобы отобрать клоны со стабильной экспрессией цитолитической активности. Повторное клонирование обычно проводят в CS-среде без каких-либо фидерных питающих клеток. Модификация известного метода Fogh, Fogh, 1964 была введена в практику нашей лаборатории д-ром Стокером. В лунки панели Costar 3524 вносили по 4-104 клеток HeLa в 1 мл среды и 1 мл среды, кондиционированной клетками тестируемых линий, или 1 мл среды, подлежащей проверке. Через 2-3 дня инкубации клетки HeLa фиксировали. После отсасывания среды в лунки наливали 750 мкл 0,6-ного цитрата. Для того чтобы вызвать гипотоническое набухание, по каплям добавляли 250 мкл дистиллированной воды и через 5 мин 1 мл свежеприготовленного фиксатора Карнуа 25 ледяной уксусной кислоты и 75 этанола. Затем жидкость из лунок отсасывали и добавляли 500 мкл свежего фиксатора. Через 10 мин удаляли фиксатор и пробы полностью высушивали. Для окрашивания ДНК добавляли двусолянокислый хинакрин 0,01-ный раствор в дистиллированной воде. Через 10 мин лунки высушивали, вырезали донышки, помещали их на предметное стекло и просматривали с помощью флуоресцентного микроскопа при стократном увеличении.

фильм пираты карибского моря, странный берега.

Для этого самок крыс Lewis не старше 5 нед забивают методом асфиксии в СОг- Стерильно удаляют у них тимус, отделяя последний от околотимусных лимфатических узлов, разрезают его на мелкие кусочки острыми ножницами и затем осторожно продавливают через стерильное ситечко, используя поршень шприца на 5 мл. Полученную клеточную суспензию дважды промывают CP 200 g, 10 мин, 4С и ресуспендируют приблизительно в 20 мл МСИДИ без сыворотки. Если слой клеток тимуса используют в тот же день, то МСИДИ должна содержать 50 мкг ЛПС на 1 мл. Вместе с тем можно приготовить этот слой за 3 дня до использования. В этом случае клетки инкубируют при 37 С и 5 С02 в МСИДИ без ЛПС. Готовят суспензию, содержащую 6-10 клеток тимуса в 1 мл, и мультиканальной пипеткой Titertek 77-890-07; Flow Laboratories Irvine, Scotland разливают по 100 мкл этой суспензии в каждую лунку панели для микротитрования. Таким образом, каждая лунка содержит 6-Ю5 клеток. Периферические лунки не используют, так как из них быстро испаряется среда. Частоту встречаемости функционально активных В-клеток в пробах, отобранных из созревающих культур, определяют методом лимитирующих разведений Lefkovits, Waldmann, 1979. Количество клеток, вносимых в микрокультуры, должно перекрывать ожидаемое число зрелых В-клеток день 0 103- 104; дни 1, 2 и 5-7 10-3-Ю2; дни 3, 4 и 10-14 30-3-Ю3. Для тестирования каждой концентрации клеток заполняют 60 одинаковых лунок. Клеточную суспензию в МСИДИ, содержащей ЛПС, разливают по 100 мкл в каждую лунку конечная концентрация ЛПС 10 мкг на лунку. Для этого используют мультипипетку Eppendorf 4780 позиция 2 с присоединенным к ней наконечником на 2,5 мл Netheler, Hinz GmbH, Hamburg, ФРГ. Культуры инкубируют 4 сут при 37 С и 5 С02. Клетки, секретирующие иммуноглобулин, подсчитывают методом обратного локального гемолиза, используя бараньи эритроциты, покрытые крысиными моноклональными антителами 33.

Мебель для детской комнаты: спальни для девочек и мальчиков.